Патент на изобретение №2239838

(54) СПОСОБ ДИАГНОСТИКИ РЕФЛЮКС-НЕФРОПАТИИ

(57) Реферат:

Изобретение относится к области медицины, а именно к нефроурологии, и может быть использовано при диагностике рефлюкс-нефропатии. Сущность изобретения состоит в том, что иммуноферментным анализом в суточной моче определяют содержание интерлейкина-8 (ИЛ-8), интерлейкина-10 (ИЛ-10) и фактора некроза опухоли альфа (ФНО-) при первичном обследовании и через 6 месяцев, и при уменьшении содержания ИЛ-10 более чем в 1,3 раза и повышении содержания ФНО- более чем в 1,4 раза по сравнению с первоначальным значением на фоне постоянной концентрации ИЛ-8 диагностируют рефлюкс-нефропатию у больных с пузырно-мочеточечниковым рефлюксом. Техническим результатом является разработка неинвазивного информативного способа ранней диагностики рефлюкс-нефропатии. 3 табл.

Изобретение относится к медицине, а именно к способам диагностики рефлюкс-нефропатии (РН), и может быть использовано в нефроурологии и педиатрии для раннего выявления формирования нефросклероза у больных с пузырно-мочеточниковым рефлюксом.

Известен способ диагностики РН, основанный на рентгенологической оценке степени поражения функционирующей паренхимы.

Недостатками этих способов (особенно при выполнении экскреторной урографии) являются инвазивность и значительная лучевая нагрузка на человека, в частности на растущий организм ребенка. Эти недостатки не позволяют использовать указанные диагностические процедуры для длительного динамического наблюдения за функциональным состоянием почек.

Известен способ диагностики РН путем ультразвукового сканирования почек с цветной допплерографией почечных сосудов. При РН отмечается уменьшение размеров почек, фрагментарное истончение почечной паренхимы, нарушение кортико-медуллярной дифференцировки и деформация контура почки. Определяется неравномерное повышение эхогенности паренхимы, преимущественно в зоне ее истончения. В этих же местах выявляется обеднение интраренального сосудистого рисунка. Обнаруженные изменения почечной ткани расцениваются как рефлюкс-нефропатия (Ольхова Е.Б., Крылова Е.М., Ефремова И.И. Возможности ультразвуковой оценки состояния почек при рефлюкс-нефропатии у детей, Эхография; 2001, т.2, 1, 61-7).

Недостатком этого способа является значительная доля субъективизма при интерпретации полученных данных и малая чувствительность у больных с большой массой тела. Это затрудняет обследование лиц подросткового возраста и взрослых.

Цитокины представляют собой биологически активные соединения, способствующие возникновению воспалительной реакции, влияющие на процессы клеточной пролиферации и осуществляющие эндогенную иммунорегуляцию. Наиболее значимыми являются интерлейкины (ИЛ): ИЛ-6, ИЛ-8, ИЛ-10 и фактор некроза опухоли- (ФНО-).

ИЛ-8 представляет собой низкомолекулярный цитокин воспаления, принадлежит к семейству хемокинов и продуцируется под воздействием бактериальных эндотоксинов и цитокинов, в основном, ФНО- и ИЛ-1. Он активирует нейтрофилы и моноциты, вызывает их хемотаксис в очаг воспаления.

ИЛ-10 относится к группе противовоспалительных факторов и может рассматриваться как антагонист ряда цитокинов. Подавляет секрецию активированными моноцитами ИЛ-1, ИЛ-6, ФНО-.

ФНО- (лимфотоксин) представляет собой полипептид, продуцируемый моноцитами/макрофагами, эндотелием, в особых случаях – активированными Т-лимфоцитами. Оказывает цитотоксическое, иммуномодулирующее и противовоспалительное действие. В результате высвобождения ФНО- повышается проницаемость капилляров, повреждается эндотелий сосудов и возникает внутрисосудистый тромбоз.

Для оценки выраженности воспалительной реакции и интенсивности процессов клеточной пролиферации особую ценность представляют методы комплексного определения способности клеток продуцировать про- и противовоспалительные цитокины.

Известен способ диагностики пиелонефрита у детей путем определения в моче интерлейкина-6 и фактора некроза опухоли –

Учитывая вышесказанное, данный способ не может быть использован для диагностики РН.

Задачей данного изобретения является разработка неинвазивного информативного способа ранней диагностики рефлюкс-нефропатии у больных до появления рентгенологических, радиологических и эхографических признаков поражения почек.

Поставленная задача достигается тем, что определяют содержание ИЛ-8, ИЛ-10 и ФНО- в суточной моче дважды: при первичном обследовании (при дебюте заболевания) и через 6 месяцев. При этом снижение содержания интерлейкина-10 более чем в 1,3 раза, повышение содержания ФНО- более чем в 1,4 раза по сравнению с первоначальным значением на фоне постоянной величины ИЛ-8 свидетельствуют о развитии рефлюкс-нефропатии у больных с пузырно-мочеточниковым рефлюксом.

Существенным отличием заявляемого способа от известных является то, что в качестве диагностического критерия используется степень изменений провоспалительных и противоспалительных интерлейкинов и фактора некроза опухоли, указывающих на развитие склеротических процессов в почечной паренхиме вследствие дисбаланса этих регуляторов.

В качестве исследуемого материала используют суточную мочу, в которой иммуноферментным методом определяют содержания ИЛ-8, ИЛ-10 и ФНО-.

Способ осуществляется следующим образом.

Сбор мочи проводится на общем режиме в течение суток; забор образцов, по 15 мл каждый, осуществляется из общего объема после измерения суточного диуреза. Образцы мочи хранятся при -20°С до проведения анализа.

Для измерения уровней изучаемых цитокинов использовались наборы для иммуноферментного анализа: “CYTELISA- IL-8”, “CYTELISA- IL-10” и “CYTELISA- TNF-” (CYTIMMUNE, USA). Применение их основано на “сэндвич”-методе твердофазного энзимсвязанного иммуносорбентного анализа (ELISA – enzyme-linked immunosorbent assay), принцип которого заключается в качественном и количественном определении изучаемого антигена путем его послойного связывания со специфичными к нему моноклональными антителами, фиксированными на поверхности лунок 96-местной планшетки. После добавления к ним изучаемых образцов или стандартов исследуемый антиген связывается с иммобилизованными антителами. После удаления методом отмывания не связавшихся протеинов в лунки добавляются поликлональные антитела, связанные с энзимом. Они наслаиваются на иммобилизованный в ходе первой инкубации антиген по принципу “сэндвича”. После этого их излишек отмывается и в лунки добавляется раствор хромогенного субстрата, который, прореагировав с энзимом, дает характерное окрашивание. По интенсивности последнего оценивается содержание в пробе исследуемого антигена.

Примеры осуществления.

Нами обследовано 123 больных в возрасте от 3 до 14 лет с хроническим пиелонефритом на фоне пузырно-мочеточникового рефлюкса (ПМР). Все дети находились в стадии клинико-лабораторной ремиссии воспалительного процесса в почках, не страдали артериальной гипертензией и нарушением почечных функций.

Наряду с рентгенологическим обследованием детям проводилась ультразвуковая оценка состояния паренхимы почек и внутрипочечной гемодинамики.

Больные были распределены на 3 группы. В первую (n=94) вошли дети с хроническим вторичным пиелонефритом на фоне пузырно-мочеточникового рефлюкса без рентгенологических и ультразвуковых признаков нефросклероза. 2-ю группу составили пациенты с хроническим вторичным пиелонефритом на фоне пузырно-мочеточникового рефлюкса и эхографическими признаками рефлюкс-нефропатии (n=12). В 3-ю группу были объединены дети с хроническим вторичным пиелонефритом на фоне пузырно-мочеточникового рефлюкса и рентгенологическими проявлениями нефросклероза (n=17).

Больные трех групп получали регулярное противорецидивное лечение уросептиками по поводу хронического пиелонефрита и курсы физиотерапии на область мочевого пузыря и мочеточников. В момент обострения пиелонефрита назначались антибактериальные препараты, в большинстве случаев согласно результатам исследования чувствительности микрофлоры мочи к антибиотикам.

В группу сравнения (n=10) вошли больные хроническим пиелонефритом без нарушения уродинамики.

Всем детям в динамике (в начале курса лечения и через 6 месяцев) проводилось определение суточной экскреции с мочой интерлейкинов: ИЛ-8, ИЛ-10 и фактора некроза опухоли- (ФНО-).

Проведенные исследования показали, что у всех больных отмечалось значительное повышение экскреции с мочой ИЛ-8, ИЛ-10 и ФНО- по сравнению с показателями в группе сравнения (р<0,05). Через 6 месяцев у больных с ПМР выявлено нарастание концентрации ФНО- в суточной моче (в 1,4 раза и более, р<0,01), независимое от наличия или отсутствия эхографических и рентгенологических признаков формирования рефлюкс-нефропатии при постоянном уровне ИЛ-8. Однако исследования противовоспалительного интерлейкина ИЛ-10 выявили отчетливую однотипность изменений его содержания у детей 2 и 3 групп: через 6 месяцев после первого исследования: у больных с рентгенологическими и ультразвуковыми признаками рефлюкс-нефропатии было установлено достоверное (в 1,3 раза и более, р<0,05) снижение концентрации ИЛ-10 в суточной моче, в то время как у пациентов 1 группы экскреция его значительно возрастала.

Результаты проведенных исследований представлены в табл.1-3.

При контрольном ультразвуковом обследовании больных 2-й группы сохранялись эхографические признаки рефлюкс-нефропатии. Рентгеноурологическое исследование состояния почечной паренхимы у детей с ранее выявленным нефросклерозом указывало на наличие очагов деструкции в почках.

Таким образом, однонаправленное выраженное снижение суточной экскреции с мочой противовоспалительного ИЛ-10 у больных 2 и 3-й групп при отсутствии существенных изменений концентраций ИЛ-8 и повышении содержания в моче ФНО- у детей с эхографическими признаками поражения почек свидетельствует о формировании очагов инфильтрации в почечной паренхиме с последующим склерозированием и может быть использовано в качестве раннего диагностического критерия развития рефлюкс-нефропатии при пузырно-мочеточниковом рефлюксе.

Клинические примеры.

Ира Р., 5 лет (история болезни 18039-01), поступила в нефрологическое отделение Московской детской клинической больницы (МДКБ) с диагнозом: правосторонний смешанный пузырно-мочеточниковый рефлюкс 2-3 степени, хронический вторичный пиелонефрит, катарально-гранулярный цистит. Обследована впервые в связи с повышением температуры, болями в животе, амбулаторно-патологической лейкоцитурией. На урограммах признаков формирования очагов нефросклероза не выявлено. Однако при ультразвуковом исследовании обнаружены изменения эхографической структуры почек и интраренального кровотока, характерные для рефлюкс-нефропатии. При первом определении суточной экскреции с мочой цитокинов было выявлено повышение всех показателей по сравнению с контролем (ФНО--340,0 пг/мл, ИЛ-8 – 523,4 пг/мл, ИЛ-10 – 122,3 пг/мл).

Через 6 мес уровень ФНО-– увеличился в 1,7 раз (до 590 пг/мл), ИЛ-8 существенно не изменился (509,6 пг/мл), а ИЛ-10 значительно (в 2,9 раза) снизился (42,5 пг/мл). При контрольном ультразвуковом обследовании эхографические признаки рефлюкс-нефропатии сохранялись. Таким образом, снижение суточной экскреции ИЛ-10 при повышении ФНО- и отсутствии значимых изменений ИЛ-8 свидетельствуют о начальных этапах развития рефлюкс-нефропатии у больной без рентгенологических признаков поражения почечной паренхимы.

Таня Ш, 9 лет (история болезни 19704-01), поступила в нефрологическое отделение МДКБ с диагнозом: левосторонний смешанный пузырно-мочеточниковый рефлюкс 2-3 степени, хронический вторичный пиелонефрит, катаральный цистит. На протяжении последних лет получала противорецидивную терапию пиелонефрита, целенаправленное лечение цистита и антирефлюксную терапию. Рентгенологическое обследование не выявило признаков поражения почечной паренхимы, однако при ультразвуковом сканировании почек были обнаружены очаги неравномерного повышения эхогенности паренхимы с обеднением интраренального сосудистого рисунка в этих же местах. При первом определении суточной экскреции с мочой цитокинов было выявлено повышение всех показателей по сравнению с контролем (ФНО- – 310,0 пг/мл, ИЛ-8 – 587,4 пг/мл, ИЛ-10 – 92,8 пг/мл). Через 6 мес. уровень ФНО--увеличился в 1,6 раз (до 497,2 пг/мл), содержание ИЛ-8 существенно не изменилось (559,3 пг/мл), а ИЛ-10 уменьшилось в 1,7 раза (до 52,5 пг/мл). При контрольном ультразвуковом обследовании эхографические признаки рефлюкс-нефропатии сохранялись. На урограммах появились признаки очагового нефросклероза слева. Таким образом, выявленные закономерности изменений содержания изученных цитокинов у данной больной подтверждают развитие рефлюкс-нефропатии.

Диана И, 9 лет (история болезни 21652-00), поступила в нефрологическое отделение МДКБ с диагнозом: правосторонний смешанный пузырно-мочеточниковый рефлюкс 2 степени, хронический вторичный пиелонефрит, правосторонняя рефлюкс-нефропатия, катарально-гранулярный цистит. Из анамнеза известно, что девочка с 5 лет страдает хроническим вторичным пиелонефритом на фоне нарушения уродинамики 3 степени. Получила несколько курсов антирефлюксной терапии. При этом степень рефлюкса уменьшилась, однако рентгенологически выявлен очаговый нефросклероз справа. Реноиндекс правой почки составляет 32%. Определение суточной экскреции с мочой цитокинов выявило определенную динамику изменения показателей: через 6 мес после первого исследования уровень ФНО- увеличился с 580 до 630 пг/ мл. Концентрация ИЛ-8 в моче существенно не изменилась (537,7 и 496,4 пг/мл). Однако суточная экскреция ИЛ-10 уменьшилась почти в 5 раз (с 51,7 до 11,3 пг/мл). Следовательно, у этой больной динамика содержания цитокинов в моче соответствуют изменениям почек на урограммах и указывает на формирование нефросклероза, несмотря на уменьшение степени пузырно-мочеточникового рефлюкса.

Таким образом, установленные закономерности изменений динамики содержания провоспалительных и противовоспалительных цитокинов у больных с пузырно-мочеточниковым рефлюксом могут быть использованы в качестве раннего диагностического критерия развития и прогрессирования рефлюкс-нефропатии. Это позволяет оценивать эффективность лечения пузырно-мочеточникового рефлюкса, своевременность его коррекции и необходимо для профилактики нарушений функционального состояния почек при данной патологии, что также поможет определить тактику лечения и наблюдения больных с нарушениями уродинамики в анамнезе.

Кроме этого, способ не требует инвазивных методов получения биологического материала и не оказывает лучевой нагрузки на больного, что позволяет осуществлять динамическое наблюдение за состоянием почечной паренхимы.

Внедрение в практическое здравоохранение указанного способа ранней диагностики рефлюкс-нефропатии у детей и адекватное лечение больных с хроническим пиелонефритом на фоне пузырно-мочеточникового рефлюкса позволяют ускорить ремиссию и сократить сроки пребывания больных в стационаре в связи с обострением основного процесса, а также уменьшить число осложнений, требующих коррекции. Предупреждение развития и замедление темпов прогрессирования нефросклероза у больных детей поможет уменьшить риск развития состояний, приводящих к нетрудоспособности в старшем возрасте.

Формула изобретения

Способ диагностики рефлюкс-нефропатии у детей с хроническим пиелонефритом на фоне пузырно-мочеточечникового рефлюкса, включающий иммуноферментный анализ суточной мочи на содержание цитокинов, отличающийся тем, что определяют содержание интерлейкина-8 (ИЛ-8), интерлейкина-10 (ИЛ-10) и фактора некроза опухоли альфа (ФНО-) при первичном обследовании и через 6 месяцев и при уменьшении содержания ИЛ-10 более чем в 1,3 раза и повышении содержания ФНО- более чем в 1,4 раза по сравнению с первоначальным значением на фоне постоянной концентрации ИЛ-8 диагностируют рефлюкс-нефропатию у больных с пузырно-мочеточечниковым рефлюксом.