Патент на изобретение №2239197

(54) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ВОЛЧАНОЧНОГО АНТИКОАГУЛЯНТА

(57) Реферат:

Изобретение относится к медицине, а именно к диагностическим методам. Сущность способа: при определении нормальных величин активированного частичного тромбопластинового времени (АЧТВ) и каолинового времени (KB) в плазме больного проводят определение факторов свертывания крови VIII и IX и при повышенной активности этих факторов плазму больного смешивают с плазмой, дефицитной по соответствующему фактору, в соотношении, обеспечивающем в конечной смеси нормальную активность этих факторов. Смесь инкубируют при 37С в течение 2 часов, определяют повторно в этой смеси величину АЧТВ и при превышении нормального времени образования сгустка и его нормализации после инкубации смеси с концентратом фосфолипидов при 37С в течение 5 мин диагностируют наличие волчаночного антикоагулянта. Способ позволяет повысить точность диагностики.

Изобретение относится к области медицины, а именно к диагностике тромботических состояний, например рецидивирующих тромбозов, тромбоэмболии, устойчивой невынашиваемости беременности и др., обусловленных присутствием в плазме крови больных волчаночного коагулянта.

В настоящее время существует метод, рекомендуемый Международным Подкомитетом по Стандартизации Волчаночных Антикоагулянтов (SSC Subcommittee for the Standardization of Lupus Anticoagulants) (1), согласно которому определение волчаночного антикоагулянта основано на последовательном измерении величин активированного частичного тромбопластинового времени (АЧТВ) и каолинового времени (KB) в образцах тестируемой бестромбоцитарной плазмы крови. При увеличении времени образования сгустка крови (принятая международными стандартами норма равна 35±5 сек и 60±10 сек соответственно) проводят последующую обработку тестируемой плазмы нормальной донорской плазмой и повторно измеряют АЧТВ и КВ. При сохранении повышенных показателей в этих реакциях истощают тестируемую сыворотку стандартным препаратом концентрата фосфолипидов и при нормализации показателей АЧТВ после повторного исследования делают вывод о наличии волчаночного антикоагулянта.

Недостатком этого метода является его невысокая специфичность, что затрудняет постановку диагноза и разработку адекватной тактики лечения больных с рецидивирующими тромбозами, тромбоэмболией, устойчивой невынашиваемостью беременности и др., у которых повышена активность факторов внутреннего пути свертывания крови (факторы VIII и IX), маскирующая удлинение времени АЧТВ и КВ.

Задачей данного изобретения является разработка высокоспецифичного способа определения волчаночного антикоагулянта в плазме больных с наличием тромботических состояний.

Сущность предлагаемого изобретения заключается в том, что у обследуемого больного берут кровь из локтевой вены, центрифугируют ее двукратно в течение 10-15 мин при 2000 g, а затем в течение 15-20 мин при 3000 g отбирают плазму крови, содержащую тромбоциты в количестве, не превышающем 1010⁹ кл/л. Затем проводят определение АЧТВ, для чего к тестируемой плазме крови в объеме 50±1 мкл (погрешность предусмотрена указаниями к стандартизованным приборам, например автоматическим пипеткам, кюветам коагулометра) добавляют 50±1 мкл кефалин-каолиновой смеси, прогревают в течение 3 мин при 37±2С, добавляют 50±1 мкл 0,025±0,0005 М раствора хлорида кальция, имеющего температуру 37±2С, и фиксируют время образования сгустка. Полученные результаты сравнивают с величиной АЧТВ нормальной плазмы, равной 35±5 сек. Для определения KB в кювете коагулометра смешивают 50±1 мкл анализируемой плазмы, 50±1 мкл суспензии каолина, прогревают в течение 3 мин при температуре 37±2С, добавляют 50±1 мкл 0,025±0,0005 М раствора хлорида кальция, имеющего температуру 37±2С, и фиксируют время образования сгустка. Полученный результат сравнивают с величиной KB нормальной плазмы, равной 60±10 сек. При нормальных величинах АЧТВ и KB в плазме больных с клинически обусловленным подозрением на тромбофилию (рецидивирующие тромбозы, тромбоэмболии) или при наличии устойчивой невынашиваемости беременности для исключения ложноотрицательных результатов, обусловленных повышенной активностью факторов свертывания крови VIII или IX, проводят определение этих факторов по унифицированной методике одностадийного количественного определения (2). При этом 50±1 мкл исследуемой плазмы, предварительно разбавленной в 5-10 раз имидазоловым буфером, вносят в кювету коагулометра, добавляют 50±1 мкл субстрат – дефицитной по фактору VIII или IX плазмы, 50±1 мкл кефалин-каолиновой смеси и 50±1 мкл 0,025±0,0005 М раствора кальция хлорида, имеющего температуру 37±2С, и фиксируют время образования сгустка. Активность фактора VIII или IX определяется по предварительно построенной калибровочной прямой, построенной с использованием Международного стандарта активности этих факторов. При выявлении повышенной активности в изучаемой плазме факторов VIII и IX смешивают 100±2 мкл исследуемой плазмы с плазмой, дефицитной по соответствующему фактору, в соотношении, обеспечивающем в конечной смеси нормальный уровень активности (100%) данного фактора свертывания крови. Смесь инкубируют при 37±2С в течение 2 час и определяют величины АЧТВ и КВ. Если эти величины остаются в пределах нормальных значений, то делают заключение об отсутствии в изучаемой плазме волчаночного антикоагулянта. В случае удлинения величины АЧТВ и/или KB выше нормальных значений делают заключение, что причиной их пролонгирования в условиях нормальной активности факторов VIII и IX (факторов внутреннего пути свертывания) является наличие антикоагулянтов. Нормализация величины АЧТВ после инкубации 100±2 мкл смеси плазм при 37±2С в течение 5 мин с 100±2 мкл концентрата фосфолипидов, полученных из эритроцитарных мембран и обеспечивающих истощение по волчаночному антикоагулянту, позволяет сделать вывод о присутствии волчаночного антикоагулянта.

Техническим результатом использования изобретения является высокая специфичность определения наличия волчаночного антикоагулянта, не зависящее от величины активности факторов VIII и IX и позволяющее проводить больному правильный курс лечения.

Способ осуществляется следующим образом. У больного берут кровь из локтевой вены, центрифугируют ее двукратно в течение 10-15 мин при 2000 g, а затем в течение 15-20 мин при 3000 g отбирают плазму крови, содержащую тромбоциты в количестве, не превышающем 1010⁹ кл/л. Затем проводят определение АЧТВ, для чего к тестируемой плазме крови в объеме 50±1 мкл (погрешность предусмотрена указаниями к стандартизованным приборам, например автоматическим пипеткам, кюветам коагулометра) добавляют 50±1 мкл кефалин-каолиновой смеси, прогревают в течение 3 мин при 37±2С, добавляют 50±1 мкл 0,025±0,0005 М раствора хлорида кальция, имеющего температуру 37±2С, и фиксируют время образования сгустка. Полученные результаты сравнивают с величиной АЧТВ нормальной плазмы, равной 35±5 сек. Для определения KB в кювете коагулометра смешивают 50±1 мкл анализируемой плазмы, 50±1 мкл суспензии каолина, прогревают в течение 3 мин при температуре 37±2С, добавляют 50±1 мкл 0,025±0,0005 М раствора хлорида кальция, имеющего температуру 37±2С, и фиксируют время образования сгустка. Полученный результат сравнивают с величиной KB нормальной плазмы, равной 60±10 сек. При нормальных величинах АЧТВ и KB в плазме больных с клинически обусловленным подозрением на тромбофилию (рецидивирующие тромбозы, тромбоэмболии) или при наличии устойчивой невынашиваемости беременности для исключения ложноотрицательных результатов, обусловленных повышенной активностью факторов свертывания крови VIII или IX, проводят определение этих факторов по унифицированной методике одностадийного количественного определения. При этом 50±1 мкл исследуемой плазмы, предварительно разбавленной в 5-10 раз имидазоловым буфером, вносят в кювету коагулометра, добавляют 50±1 мкл субстрат – дефицитной по фактору VIII или IX плазмы, 50±1 мкл кефалин-каолиновой смеси и 50±1 мкл 0,025±0,0005 М раствора кальция хлорида, имеющего температуру 37±2С, и фиксируют время образования сгустка. Активность фактора VIII или IX определяется по предварительно построенной калибровочной прямой, построенной с использованием Международного стандарта активности этих факторов. При выявлении повышенной активности в изучаемой плазме факторов VIII и IX смешивают 100±2 мкл исследуемой плазмы с плазмой, дефицитной по соответствующему фактору, в соотношении, обеспечивающем в конечной смеси нормальный уровень активности (100%) данного фактора свертывания крови. Смесь инкубируют при 37±2С в течение 2 час и определяют величины АЧТВ и КВ. Если эти величины остаются в пределах нормальных значений, то делают заключение об отсутствии в изучаемой плазме волчаночного антикоагулянта. В случае удлинения величины АЧТВ или KB выше нормальных значений делают заключение, что причиной их пролонгирования в условиях нормальной активности факторов VIII и IX (факторов внутреннего пути свертывания) является наличие антикоагулянтов. Нормализация величины АЧТВ после инкубации 100±2 мкл смеси плазм при 37±2С в течение 5 мин с 100±2 мкл концентрата фосфолипидов свидетельствуе о присутствии волчаночного антикоагулянта в исследуемой плазме.

Пример 1

В плазме больного Б с рецидивирующими тромботическими осложнениями (венозный тромбоз нижних конечностей с отеком и болевыми эпизодами) определяют величины АЧТВ и каолинового времени.

Для измерения АЧТВ в кювете коагулометра смешивают 50 мкл плазмы, полученной из венозной крови двукратным центрифугированием (12 минут при 2000 g и 17 минут при 3000 g) и содержащей 810⁹ кл/л, 50 мкл кефалин-каолиновой смеси, прогревают в течение 3 минут при 37С, добавляют 50 мкл предварительно прогретого при 37С 0,025 М кальция хлорида, определяют время образования сгустка и сравнивают его с величиной АЧТВ нормальной плазмы, равной 35±5 секунд. Для определения каолинового времени в кювете коагулометра смешивают 50 мкл анализируемой плазмы, 50 мкл суспензии каолина, прогревают при 37С в течение 3 минут, добавляют 50 мкл предварительно прогретого при 37С 0,025 М кальция хлорида, фиксируют время образования сгустка и полученный результат сравнивают с величиной каолинового времени нормальной плазмы (60±10 секунд). Величины АЧТВ и каолинового времени оказались равны 33 и 57 секунд соответственно, что от нормы не отличалось, но оставляло открытым вопрос о причинах тромбоза. Поэтому в дальнейшем определяют активность фактора VIII. В кювету коагулометра вносят 50 мкл плазмы больного, предварительно разбавленной в 5 раз имидазоловым буфером, добавляют 50 мкл субстрат – дефицитной по фактору VIII плазмы, 50 мкл кефалин-каолиновой смеси, 50 мкл прогретого при 37С 0,025 М раствора кальция хлорида, фиксируют время образования сгустка и по предварительно построенной калибровочной кривой с использованием плазмы, аттестованной по активности фактора VIII с помощью Международного Стандарта, определяют активность фактора VIII, которая была равна 250%, что предполагает возможность неправильной интерпретации гемостазиологического статуса больного. Для исключения этой возможности 50 мкл плазмы больного Б смешивают с 50 мкл плазмы, дефицитной по фактору VIII (в соотношении 1:1), инкубируют в течение 2 часов при 37С и после инкубации определяют величины АЧТВ и каолинового времени, которые оказались равны 47 и 85 секунд соответственно. При этом нормы АЧТВ и каолинового времени составляют 35±5 сек и 60±10 сек. Превышение величин этих показателей в условиях достигнутой нормализации активности фактора VIII свидетельствует о наличии коагулологической аномалии у больного Б. Для идентификации возможности присутствия у больного волчаночного антикоагулянта 100 мкл исследуемой смеси плазмы больного Б и дефицитной по фактору VIII плазмы смешивают с 100 мкл концентрата фосфолипидов и инкубируют в течение 5 минут при 37С. Определенная в этой смеси величина АЧТВ составила 38 сек, что входит в пределы нормальных значений этого показателя. Нормализация этого показателя в присутствии избытка фосфолипидов говорит о наличии в исследуемой плазме антител именно к фосфолипид-белковым комплексам, т.е. волчаночного антикоагулянта. На основании полученных результатов сделано заключение о наличие в плазме больного Б волчаночного антикоагулянта.

ЛИТЕРАТУРА

1. Exner Т. et al. Thromb. Haemost.,1991, v.65, p.320-322.

2. Biggs R., Rizza C. Human blood coagulation, haemostasis and thrombosis. London, Blackwell Scientific Publications, Third Ed., 1984.

Формула изобретения

Способ определения волчаночного антикоагулянта в плазме больных с тромбофилией, включающий измерение величин активированного частичного тромбопластинового времени (АЧТВ) и каолинового времени (KB), отличающийся тем, что при нормальных значениях АЧТВ и KB проводят определение факторов свертывания крови VIII и IX и при повышенной активности этих факторов плазму больного смешивают с плазмой, дефицитной по соответствующему фактору, в соотношении, обеспечивающем в конечной смеси нормальную активность этих факторов, смесь инкубируют при 37С в течение 2 ч, определяют повторно в этой смеси величину АЧТВ и при превышении нормального времени образования сгустка и его нормализации после инкубации смеси с концентратом фосфолипидов при 37С в течение 5 мин диагностируют наличие волчаночного антикоагулянта.