Патент на изобретение №2237914

(54) СПОСОБ ОЦЕНКИ РАДОНОВОГО ЗАГРЯЗНЕНИЯ ПОМЕЩЕНИЙ И СПОСОБ ПОДГОТОВКИ ПРОБ

(57) Реферат:

Заявляемое изобретение относится к области биодозимерии помещений и может быть применено для биодозимерии радона, а также выявления создаваемых им с другими поллютантами жилых помещений синергических биологических эффектов. Способ заключается в проведении анализа по нескольким цитогенетическим показателям в апикальной меристеме корня на одном растительном биоиндикаторе, в качестве которого используется Zebrina pendula Schnizl. Анализируют митотическую активность, ядрышковые характеристики, уровень и спектр патологии митоза. Технический результат: повышение достоверности оценки радонового загрязнения помещений. 2 с. и 8 з.п. ф-лы, 1 табл., 8 ил.

Заявляемое изобретение относится к области биодозимерии помещений и может быть применено для биодозиметрии радона, а также выявления создаваемых им с другими поллютантами жилых помещений синергических биологических эффектов.

Основным методом, используемым повсеместно для измерения радона, является определение его интегральной объемной активности (заявка РФ №95111197, G 01 T 1/167, опубл. 20.06.1997; патент РФ №2123192, G 01 T 1/167, опубл. 10.12.1998).

Все ныне существующие приборы для дозиметрии радона измеряют концентрацию радона или единомоментно (однако этот способ, несмотря на быстроту, не может дать точную оценку активности радона в помещении, т.к. его содержание может значительно изменяться в течение суток), или же угольные детекторы измеряют концентрацию радона в воздухе в течение нескольких суток. Общим недостатком всех этих детекторов является невозможность отслеживания совокупных эффектов радона и других поллютатнтов (их синергические эффекты) (заявка РФ №95111197, G 01 T 1/167, опубл. 20.06.1997; патент РФ №2123192, G 01 T 1/167, опубл. 10.12.1998) и прямой оценки вызываемых эффектов непосредственно у живых организмов. Для применяемых в настоящий момент биологических тест-систем и тест-объектов для оценки генотоксичности окружающей среды (они реагируют на возможные синергические эффекты поллютантов) отсутствуют данные по эффектам воздействия радона на них (возможно, они не чувствительны к радоновой радиации) (патент РФ №2145711, G 01 T 1/167; патент РФ №2092870, G 01 T 1/167) и не построена шкала для его количественной оценки. Обычно указанные тест-объекты дают ответ по принципу “да-нет” (есть ли эффект загрязнения или его нет). Каждый из существующих ныне тест-обектов использует, как правило, один критерий, каждый из которых обладает различной чувствительностью к стрессовым воздействиям. В настоящее время нет тест-систем, использующих несколько критериев на одном тест-объекте.

Заявляемое изобретение предназначено для оценки загрязнения радоном жилых помещений и возможных биологических эффектов от синергического взаимодействия радона и других поллютантов жилых помещений.

При его осуществлении можно провести оценку радонового загрязнения жилых помещений и его биологических эффектов от синергических взаимодействий этого благородного газа и других поллютантов, а также установить пригодность помещений для проживания людей по показателю “радоновое загрязнение”.

Вышеуказанная задача решается тем, что проводят анализ нескольких цитогенетических показателей в апикальной меристеме корня на одном биоиндикаторе, сравнивают их с контролем и созданной шкалой, отражающей изменчивость цитогенетических показателей биоиндикатора при облучении различными эквивалентными равновесными объемными активностями (ЭРОА) радона, затем определяют интегральный биологический эффект радонового загрязнения.

В качестве биоиндикатора используется Zebrina pendula Schnizl., а в качестве цитогенетических показателей – ядрышковые характеристики, митотическая активность, уровень и спектр нарушений митоза, микроядерный тест.

При их анализе ведут подсчет общего количества просмотренных клеток (не менее 400), количества делящихся клеток и из них числа клеток, имеющих патологии митоза, количества метафаз, анафаз, телофаз с остаточным ядрышком, учитывают количество клеток с 1, 2, 3… n ядрышками. У традесканции при облучении подсчитывают количество клеток с микроядрами и с остаточными ядрышками в цитоплазме интерфазных клеток. На основании полученных данных определяют: 1) митотическую активность, показателем которой является митотический индекс (MI) (%-ное отношение числа делящихся клеток к общему числу клеток), 2) количество клеток с патологиями митоза от общего числа делящихся клеток (%), 3) ядрышковую активность, под которой понимают %-ное соотношение клеток с 1, 2, 3… n ядрышками в изучаемой выборке. % клеток с n ядрышками считают как отношение клеток с n ядрышками к общему числу интерфазных клеток. Под термином “увеличение ядрышковой активности” подразумевают возрастание доли клеток с большим количеством ядрышек, а под термином “уменьшение ядрышковой активности” -возрастание количества клеток с меньшим числом ядрышек по сравнению с контролем, 4) число ядрышек на клетку, 5) % клеток с микроядрами (отношение числа клеток с микроядрами к общему числу интерфазных клеток), 6) % клеток с остаточным ядрышком в цитоплазме (отношение числа клеток с остаточным ядрышком в цитоплазме к общему числу интерфазных клеток).

Данные, полученные в опыте, сравнивают с результатами контрольного эксперимента и приведенной ниже шкалы. Сравнение результатов опыта и контроля проводят по митотической активности, ядрышковой активности по t-критерию Стьюдента; по остаточным ядрышкам, нарушениям митоза, микроядерному тесту – по Х-критерию Ван-дер-Вардена и U-критерию Вилкоксона.

Свежесрезанные побеги Zebrina pendula Schnizl. помещаются в стандартные 0,7 л банки с отфильтрованной водопроводной водой. Воду отделяют от окружающего воздуха двумя плотно подогнанными слоями полиэтиленовой пленки во избежание его попадания в воду. Банку с побегами помещают в исследуемое помещение на солнечную сторону (параллельно ставится контроль в помещении с контролируемыми условиями), температура в исследованных помещениях должна быть не ниже +20С. По истечение 14 дней придаточные корни, которые выросли за время эксперимента, в 15 часов дня фиксируют в растворе ацетоалкоголя (3 части 96% этилового спирта:1 часть ледяной уксусной кислоты). Время нахождения материала в фиксаторе не менее 1 суток, в фиксаторе материал может храниться продолжительное время при температуре +4С. После фиксации материал извлекается из ацетоалкоголя и из апикальной меристемы корня изготавливаются давленые микропрепараты по следующей методике:

1) для мацерации тканей кончики корешков традесканции помещают в 18%-ную соляную кислоту и подогревают (несколько раз) до температуры 60С;

2) материал ополаскивают 45%-ной уксусной кислотой;

3) заливают красителем ацетогематоксилином корни традесканции на 25 минут при комнатной температуре;

4) отдифференцировают от избыточного красителя дистиллированной водой;

Изготовленный таким образом давленый микропрепарат может храниться в закрытой коробке в течение 2-3 лет.

Анализ микропрепаратов проводится на микроскопе при увеличении 101,540 и 101,5100. Всего анализируется в каждом опыте не менее 7 микропрепаратов.

На фиг.1 представлена шкала для определения ЭРОА радона в воздухе по цитологическим аномалиям в меристеме корней Zebrina pendula.

На фиг.2 представлены значения митотического индекса (а) и уровня патологий митоза (б) в корнях Zebrina pendula, облученной ЭРОА радона 100, 1800, 6100 Бк/м³ в течение 28 дней.

На фиг.3 представлена ядрышковая активность в корнях Zebrina pendula, облученной ЭРОА радона 100, 1800, 6100 Бк/м³ в течение 28 дней.

На фиг.4 представлена ядрышковая активность в корнях Zebrina pendula, облученной ЭРОА радона 1800 и 6100 Бк/м³ в течение 14 дней.

На фиг.5 представлена митотическая активность (а) и уровень патологий митоза (б) в корнях Zebrina pendula, облученной ЭРОА радона 1800 и 6100 Бк/м³ в течение 14 дней.

На фиг.6 представлена митотическая активность (а) и уровень патологий митоза (б) в корнях Zebrina pendula, облученной ЭРОА радона 1800 Бк/м³ в течение 3 месяцев.

На фиг.7 представлена ядрышковая активность в корнях Zebrina pendula, облученной ЭРОА радона 1800 Бк/м³ в течение 3 месяцев.

На фиг.8 представлено влияние эффекта положения на цитогенетические показатели Zebrina pendula, облученной ЭРОА радона 6100 Бк/м³ в течение 14 дней.

Опираясь на концепцию беспорогового воздействия радиации (Дубинин, 1961, 1990; Ли, 1963; Шевченко, Померанцева, 1985), мы можем сказать, что любое статистически достоверное повышение ядрышковой активности свидетельствует о превышении предельно допустимых концентраций (200 и 400 Бк/м³).

Появление остаточного ядрышка в метафазе, анафазе и телофазе митоза (~1-2%) говорит о том, что концентрация радона превышает уровень 1800 Бк/м³.

Увеличение частоты встречаемости остаточного ядрышка в митозе (~до 10%), а также расширение спектра аномалий митоза (появление слипания хромосом) показывают, что объемная концентрация радона превышает уровень 5500 Бк/м³.

Появление остаточного ядрышка в цитоплазме неделящихся клеток, статистически достоверное увеличение патологий митоза указывают на повышение концентраций радона до уровня 27500 Бк/м³.

Статистически достоверное уменьшение митотической активности связано со значением ЭРОА более 27500 Бк/м³.

Таким образом, используя цитогенетические критерии, можно эффективно проводить дозиметрию объемных концентраций радиоактивного газа радона в жилых помещениях, используя созданную шкалу для оценки загрязнения жилых помещений радоном (фиг.1).

Пример 1.

Нами были проведены работы по изучению цитогенетических характеристик зебрины повислой при облучении радоном в течение 14 дней (ЭРОА 1800 Бк/м³, 6100 Бк/м³), в течение 28 дней (ЭРОА 100 Бк/м³, 1800 Бк/м³) и 3 месяцев (объемная концентрация 1800 Бк/м³). Источником радона служил сернокислый уран. Активности создавались в прозрачных колпаках объемом 0,5 м³. Подготовку материала к облучению, его фиксацию и изготовление микропрепаратов проводили по описанной выше методике. Результаты эксперимента представлены на фиг.2, 3, 4, 5, 6, 7, 8. При облучении растений радоном объемной активностью 100 Бк/м³ отклонений цитогенетических показателей от контрольных не обнаружено (фиг.2, 3). Это можно объяснить исходя из концепции беспорогового действия радиации (Дубинин, 1961, 1990; Ли, 1963; Шевченко, Померанцева, 1985), возникающими скрытыми повреждениями, которые данным методом не могут выявляться, или недостаточной концентрацией мигрирующих из листьев в корни радиотоксинов, способных вызвать биологический эффект. Увеличение ЭРОА радона до 1800 Бк/м³ (при времени облучения 14 дней) приводило к возрастанию ядрышковой активности (фиг.4, 5), появлению остаточного ядрышка в метафазе-телофазе митоза (до 2,7%), в контроле такое нарушение отсутствовало. Наблюдаемое усиление ядрышковой активности, а также пуфинг хромосом в метафазе митоза в период облучения могут быть обусловлены ослаблением под действием радиации степени конденсации хроматина ядрышкообразующих районов за счет нарушения взаимодействия ДНК-белок. Следствием этого будет недостаточная инактивация рибосомных генов в хромосомах. Усиление ядрышковой активности можно рассматривать как компенсаторный механизм клеток, обеспечивающий синтез необходимого количества белков в условиях подавления функции многих уникальных генов радиацией. Характер пуфинга метафазных хромосом, завершающегося выбрасыванием ядрышкоподобного тельца в цитоплазму, свидетельствует о возможности увеличения числа рибосомных генов путем их амплификации. Появление остаточного ядрышка в метафазе, анафазе и телофазе митоза наблюдалось Буториной у проростков дуба черешчатого из района Чернобыльской АЭС (Буторина, Исаков, 1989; Butorma et al., 1997).

При более длительном времени облучения (28 дней) при той же ЭРОА (1800 Бк/м³) происходило возрастание ядрышковой активности (фиг.3). Однако клетки с остаточным ядрышком в митозе исчезали. Митотическая активность различалась с контролем по F-критерию Фишера (Р<0,05). Это, скорее всего, связано с тем, что при увеличении времени воздействия радиации начинается процесс элиминации наиболее радиочувствительных клеток, а хронический приток радиотоксинов из облучаемых листьев создает стрессовые условия радиационной интоксикации корней.

При облучении в течение 3 месяцев ЭРОА 1800 Бк/м³ наблюдались различия только между значениями митотической активности по F-критерию Фишера (Р<0,05) (фиг.6, 7). Это свидетельствует о завершении процесса элиминации радиочувствительных клеток и возможном неравномерном распределении радиотоксинов между корнями растения.

При увеличении объемной активности радона до 6100 Бк/м³ (14 дней) происходило возрастание ядрышковой активности (фиг.4) и увеличение количества метафаз-телофаз с остаточным ядрышком (до 9,6%) по сравнению с контрольными данными. Однако при сопоставлении с данными по облучению объемной активностью 1800 Бк/м³ в течение 14 дней статистически достоверных различий не наблюдалось. Предположительно, это, скорее всего, связано с выходом системы на новый триггерный уровень. Это согласуется с концепцией Гераськина (Гераськин, 1995) о возможности существования в области малых доз интервалов, на которых клетка способна справиться с увеличивающимся стрессовым воздействием без изменения функциональных показателей.

Дополнительно исследовали зависимость эффекта от положения облучаемого объекта (вверху (активность радона 5500 Бк/м³) и внизу (активность радона 6100 Бк/м³) колпака, а также под полиэтиленовым навесом). Наличие эффекта могло быть обусловлено дополнительным облучением растений оседающими продуктами распада радона. Данные представлены на фиг.8. Статистически достоверных различий в зависимости от положения не обнаружено. На основании этого можно говорить о незначительности влияния эффекта положения традесканции в опыте на цитогенетические показатели. Следовательно, возможно предположить, что основное воздействие происходит за счет внешнего и внутреннего облучения радоном и осевших на листья аэрозолей (продуктов распада) и инкорпорированного облучения этими же частицами, а не за счет облучения частицами, находящимися вблизи (т.е. на поверхности колпака) растения.

Пример 2.

Проводили облучение зебрины повислой ЭРОА радона 27500 Бк/м³. Источником радона служил сернокислый уран. Активности создавались в прозрачных колпаках объемом 0,5 м³. Подготовки материала к облучению, его фиксации и изготовление микропрепаратов проводили по описанной выше методике.

Данные по митотической активности, количеству нарушений митоза, ядрышковой активности у биоиндикатора представлены в таблице.

Под действием радона у исследуемого вида наблюдали широкий спектр аномалий митозов. Спектр патологий митозов у Z. pendula в контроле был представлен (классификация по Алову (1965)) отставанием хромосом в метакинезе. Типы отклонений в протекании митоза у облученных растений -слипание хромосом, отставание хромосом в метакинезе и анафазе, мосты.

Следует особо отметить, что при облучении у 0,3% клеток встречались микроядра (4 на 1596 просмотренных интерфазных клеток), которые являются прямым тестом на действие радиации. У Z. pendula происходило статистически достоверное увеличение числа патологий митоза (для Х-критерия рангов Вандер-Вардена Р<0,05, для U-критерия Вилкокксона Р<0,01). Отмечена также тенденция к снижению митотической активности.

Обнаружено статистически достоверное увеличение (Р<0,001) ядрышковой активности по сравнению с контролем, что можно трактовать как реакцию на стрессовое воздействие облучения и рассматривать изменение ядрышковых характеристик как наиболее чувствительный критерий при воздействии радона.

У зебрины повислой при воздействии радоном наблюдалось явление присутствия оптически плотного, отличающегося по окраске от ядра и сходного по окраске с ядрышком ядрышкоподобного образования в цитоплазме интерфазных клеток, которое можно квалифицировать как остаточное ядрышко.

В связи с тем, что происходило облучение верхней части растения, а радиационные эффекты наблюдались в необлученных корешках, можно говорить о опосредованном воздействии радиации. Сходные опыты были проведены Кузиным (1986), зарегистрировано ингибирование корнеобразования у спиреи при облучении верхушечных почек веток (Krjukova, 1979). А.М.Кузин с соавторами полагают, что ответственны за опосредованное действие облучения радиотоксины – вещества, возникающие в облученных клетках и выполняющие очень важную роль в индукции лучевого патогенеза (Копылов и др., 1966; Кузин, Копылов, 1983; Кузин, 1984; Кузин, 1986).

Формула изобретения

1. Способ оценки радонового загрязнения помещений, заключающийся в проведении анализа, по крайней мере, не менее двух цитогенетических показателей в апикальной меристеме корня на одном растительном биоиндикаторе, сравнение их с контролем и созданной шкалой, отражающей изменение цитогенетических показателей биоиндикатора при облучении различными известными эквивалентными равновесными объемными активностями радона, по которому определяют биологический эффект радонового загрязнения.

2. Способ по п.1, отличающийся тем, что в качестве растительного биоиндикатора используется Zebrina pendula Schnizl.

3. Способ по пп.1 и 2, отличающийся тем, что в качестве цитогенетических показателей используют митотическую активность, ядрышковые характеристики, уровень и спектр патологий митоза, микроядерный тест.

4. Способ по п.3, отличающийся тем, что при анализе митотической активности, показателем которой является митотический индекс (МI), ведется подсчет %-ного отношения числа делящихся клеток к общему числу клеток.

5. Способ по п.3, отличающийся тем, что ведется подсчет количества клеток с патологиями митоза от общего числа делящихся клеток (%) и определяется спектр нарушений митоза.

6. Способ по п.3, отличающийся тем, что анализируется ядрышковая активность, по которой понимают %-ное соотношение клеток с 1, 2, 3 … n ядрышками в изучаемой выборке, % клеток с n ядрышками считают как отношение клеток с n ядрышками к общему числу интерфазных клеток.

7. Способ по п.6, отличающийся тем, что рассчитывают число ядрышек на клетку.

8. Способ по п.7, отличающийся тем, что считают % клеток с остаточным ядрышком в цитоплазме (отношение числа клеток с остаточным ядрышком в цитоплазме к общему числу интерфазных клеток).

9. Способ по п.6, отличающийся тем, что вычисляют % клеток с микроядрами (отношение числа клеток с микроядрами к общему числу интерфазных клеток).

10. Способ подготовки проб для оценки радонового загрязнения, согласно которому в качестве биоиндикатора используется Zebrina pendula Schnizl., заключающийся в том, что свежесрезанные побеги Zebrina pendula Schnizl. помещают в емкости с отфильтрованной водой, изолированной от окружающего воздуха, емкости устанавливают в обследуемом помещении на солнечную сторону, выдерживают их там не менее 14 дней при температуре не ниже 20С, затем фиксируют боковые корни, выросшие за время эксперимента, в растворе ацетоалкоголя, после фиксации изготавливают давление микропрепараты по известной методике.

РИСУНКИ

MM4A – Досрочное прекращение действия патента СССР или патента Российской Федерации на изобретение из-за неуплаты в установленный срок пошлины за поддержание патента в силе

Дата прекращения действия патента: 19.03.2007

Извещение опубликовано: 20.02.2008 БИ: 05/2008