Патент на изобретение №2152037

(54) СПОСОБ ДИАГНОСТИКИ ИЕРСИНИОЗОВ

(57) Реферат:

Изобретение предназначено для иммуноферментной серодиагностики (ИФА) кишечного иерсиниоза, вызванного различными серовариантами Yersinia enterocolitica. Для сенсибилизации полистироловой планшеты берут инактивированный корпускулярный антиген из штамма Y. enterocolitica сероварианта 0:3. Антиген используют в забуференном физрастворе с рН 7,3 с оптической плотностью 0,1 о. е. мутности, устанавливаемой при длине волны 540 нм в кювете толщиной 10 мм. Сенсибилизацию полистироловой планшеты осуществляют путем ее инкубации в течение 15 мин при 37^oC. Для проверки специфичности и чувствительности тест-системы вносят гипериммунные кроличьи сыворотки различных серовариантов (0: 3, 0: 5, 0:6, 0:7, 0:8, 0:9), антииерсиниозные сыворотки крупного рогатого скота (КРС) к сероварианту 0:9, позитивные антибруцеллезные КРС и кролика, нормальные сыворотки кролика и КРС в разведении 1:400. Инкубируют 1 ч при комнатной температуре. Добавляют антикроличий пероксидазный конъюгат. После инкубации вносят субстратную смесь для ИФА. Через 10 – 20 мин реакцию останавливают серной кислотой. Учет реакции проводят фотометрически. Новая тест-система иммуноферментной диагностики кишечного иерсиниоза является более чувствительной, с более широкой специфичностью, а также менее трудоемкой в проведении исследований. Изобретение позволит повысить эффективность проводимых исследований на иерсиниоз. 4 табл.

Изобретение относится к области ветеринарии и может быть использовано в медицинской практике для иммуноферментной серодиагностики кишечного иерсиниоза, вызванного различными серовариантами Yersinia enterocolitica.

Известен способ диагностики иерсиниозов, в частности реактивного артрита у людей, включающий сенсибилизацию полистироловой планшеты липополисахаридным антигеном (ЛПС), выделенным из клеток Yersinia enterocolitica серотипа 0:3, последующую отмывку его от несвязавшегося антигена и выявление антител в сыворотках крови с помощью ферментной метки (коммерческая ИФА тест-система DAKO производство Дании) (1).

Недостатком данного способа является менее высокая чувствительность к выявлению иерсиниозов, вызванных серотипами 0:5, 0:7, 0:8. Кроме того для выполнения способа требуется очищенный антиген, на получение которого затрачивается значительное время, что усложняет его.

Известен также способ диагностики иерсиниозов (иерсиниоза и псевдотуберкулеза у людей), включающий сенсибилизацию полистироловой планшеты протеиновым антигеном, свободно секретируемым в культуральную среду патогенными иерсиниями, в частности Y. pseudotuberculosis 01, с последующим выявлением антител в сыворотках крови с помощью ферментной метки (2).

Недостатком данного способа является также менее высокая чувствительность и специфичность. Способ не позволяет с высокой достоверностью диагностировать иерсиниоз, вызванный Y. enterocolitica серотипа 0:9 ввиду общей антигенной детерминанты их ЛПС (4,6-дезокси-4-формамидо-L-D-маннопиранозила), присущей данному серотипу и различным видам бруцелл. Кроме того, способ более трудоемок в исполнении и на получение используемого антигена требуются значительные затраты времени и средств.

Целью изобретения является повышение чувствительности и специфичности способа иммуноферментной диагностики иерсиниозов, а также его упрощение. Поставленная цель достигается тем, что в качестве антигена для сенсибилизации полистироловой планшеты используют инактивированный корпускулярный антиген из штамма Y. enterocolitica сероварианта 0:3 в забуференном физиологическом растворе (ЗФР) с pH 7,3 с оптической плотностью 0,1 о.е. мутности, устанавливаемой при длине волны 540 нм в кювете толщиной 10 мм, а сенсибилизацию полистироловой планшеты указанным антигеном осуществляют путем ее инкубации при 37^oC в течение 15 мин.

Для осуществления способа иммуноферментной диагностики иерсиниозов используют инактивированный иерсиниозный антиген из референтного штамма Y. enterocolitica сероварианта 0:3, выращенного на агаре Хоттингера.

Изобретение иллюстрируется следующими примерами.

Пример 1. Изучают влияние сенсибилизирующей дозы инактивированного корпускулярного антигена из штамма Y. enterocolitica сероварианта 0:3 на величину показателей Единиц ИФА (БД ИФА) гипериммунной сыворотки к Y. enterocolitica 0:3 при постановке твердофазного ИФА, осуществляемого в стандартном непрямом варианте. Для постановки ИФА используют разведения указанного антигена в забуференном физиологическом растворе (ЗФР, pH 7,3) со следующими значениями оптической плотности, измеренной при длине волны 540 нм в кювете толщиной 10 мм, (ОП₅₄₀): 0,5; 0,2; 0,1; 0,05 и 0,01 о.е. мутности. Антиген вносят в микротитраторную полистироловую планшету по 100 мкл/лунку и осуществляют ее сенсибилизацию при инкубации в течение 60 мин при 37^oC. Планшету отмывают от неприсоединившегося антигена трижды холодной водопроводной водой и 1 раз ЗФР и тщательно стряхивают. Затем в лунки вносят гипериммунную кроличью антииерсиниозную (0:3), а в другие, в качестве контроля, отрицательную (от здорового кролика) сыворотки, взятые в разведении 1:25 600. Инкубацию с сыворотками проводят 1 час при комнатной температуре. После отмывки лунок от несвязавшихся антител в них добавляют антикроличий пероксидазный конъюгат в подобранном рабочем разведении. Инкубируют 1 ч при комнатной температуре. Отмывают. Тщательно стряхивают и добавляют по 100 мкл/лунку субстратной смеси ОФД (орто-фенилендиамин 10 мг, 40 мкл 3% перекиси водорода и 20 мл цитратно-фосфатного буфера, pH 5,5). Через 10 – 20 мин ферментативную реакцию останавливают добавлением 25 мкл/лунку 0,5М серной кислоты (H₂SO₄). Учет реакции проводят на вертикальном фотометре MicroELISA Auto Reader MR 580 (Dynatech, США) при длине волны 490 нм (ОП₄₉₀), прибор бланкируют по воздуху. Результаты реакции выражают в единицах иммуноферментного анализа (ЕД ИФА). Данный показатель рассчитывают по формуле:

где ОП_х – средняя оптическая плотность лунок с исследуемым образцом;
ОП_о – средняя оптическая плотность лунок с отрицательной контрольной сывороткой. За положительные принимают значения ОП₄₉₀ испытуемой сыворотки не менее, чем в 2 раза превышающие ОП₄₉₀ отрицательного контроля, выраженные в процентах плюс удвоенное среднее квадратическое отклонение (т.е. ЕД ИФА+2 ). В нашем исследовании этот показатель равен 244. Результаты представлены в табл. 1.

Из табл. 1 следует, что оптимальной сенсибилизирующей дозой антигена является суспензия клеток с ОП₅₄₀, равной 0,1 о.е. При этом разведении позитивная сыворотка дает достаточно высокие показатели ЕД ИФА, тогда как в последующих разведениях происходит их снижение.

Пример 2. Изучают влияние времени инкубации на адсорбцию корпускулярного инактивированного антигена из штамма Y. enterocolitica сероварианта 0:3 в лунках полистироловых планшет с использованием оптимальной концентрации микробных клеток (ОП₅₄₀ 0,1 о.е в ЗФР с pH 7,3). Сенсибилизацию лунок проводят в течение 5, 10, 15, 30, 60 и 120 минут при 37^oC.

После сенсибилизации в лунки вносят по 100 мкл гипериммунной кроличьей анти-0: 3 сыворотки а в другие, в качестве контроля, отрицательную сыворотку здоровых животных, взятых в одном разведении (1:12800). Далее опыт проводят как описано в примере 1 с момента внесения сывороток. Результаты представлены в табл. 2.

Полученные данные позволяют сделать вывод о том, что оптимальным режимом сенсибилизации полистироловых планшет корпускулярным иерсиниозным антигеном из штамма Y. enterocolitica сероварианта 0:3 является инкубация их при 37^oC в течение 15 минут. Сенсибилизация лунок в течение 5 и 10 минут несколько снижает чувствительность реакции по сравнению с 15-минутной инкубацией. Тогда как увеличение времени инкубации более 15 минут не приводит к сколько-нибудь значительному росту интенсивности окраски конечного продукта реакции и показателей ЕД ИФА.

Пример 3. Изучают влияние pH буферных растворов: фосфатный буфер (pH 5,8 и 8,2), карбонат-бикарбонатный буфер (pH 9,8), ЗФР (pH 7,3), используемых для разведения инактивированного корпускулярного антигена из штамма Y. enterocolitica сероварианта 0:3, на показатели ОП₄₉₀ конечных продуктов реакции, выраженных в ЕД ИФА. Сенсибилизацию проводят в подобранных оптимальных условиях (ОП₅₄₀ 0,1 о.е., 15 мин при 37^oC). После сенсибилизации и отмывки в лунки вносят по 100 мкл положительной анти-иерсиниозной (0:3) сыворотки и отрицательной сыворотки здоровых животных, взятых в одном разведении (1: 25600) в буферном растворе с аналогичным значением pH. Далее опыт проводят как описано в примере 1 с момента добавления сыворотки. Результаты представлены в табл. 3.

Результаты, представленные в табл. 3, свидетельствуют о том, что оптимальным значением pH комплексирующего буфера для разведения антигена при сенсибилизации полистироловых планшет является значение 7,3. При использовании буфера с pH 6,1 в лунках с отрицательной сывороткой наблюдается значительное окрашивание (фон), т.е. понижается специфичность реакции. При использовании буферов с pH 8,2 и 9,8 понижается чувствительность реакции, что выражается в некотором снижении ОП₄₉₀ положительной сыворотки. В обоих случаях происходит уменьшение величин ЕД ИФА.

Все дальнейшие испытания в предлагаемой диагностической системе проводят на планшетах, сенсибилизированных инактивированным корпускулярным антигеном из штамма Y. enterocolitica сероварианта 0:3, с учетом подобранных оптимальных условий: концентрация антигена по ОП₅₄₀ 0,1 о.е. мутности в ЗФР с pH 7,3 в течение 15 мин при 37^oC.

Пример 4. Специфичность и чувствительность различных тест-систем оценивают путем сравнения ЕД ИФА гипериммунных кроличьих сывороток, полученных к различным серовариантам Y. enterocolitica 0:3, 0:5, 0:6, 0:7, 0:8, 0:9; коммерческих сывороток к бруцелле, сальмонеллам, шигеллам, E.coli; нормальных кроличьих и КРС сывороток. Гипериммунные антииерсиниозные сыворотки получают после 3-кратной иммунизации кроликов культурами иерсиний, инактивированными 50% раствором этилового спирта. Активность полученных сывороток контролируют в РА.

Полистироловые планшеты сенсибилизируют инактивированным корпускулярным иерсиниозным антигеном из штамма Y. enterocolitica сероварианта 0:3 в оптимальном отработанном режиме. Для сравнения используют планшеты, сенсибилизированные протеиновым антигеном, полученным из культуральной ростовой среды Y. enterocolitica 0:3 по способу, описанному в прототипе и планшеты из коммерческой тест-системы DAKO (Дания), сенсибилизированные ЛПС Y. enterocolitica 0: 3 (аналог). Исследуют сыворотки: гипериммунные кроличьи к иерсиниям различных серовариантов (0: 3, 0:5, 0:6, 0:7, 0:8, 0:9), антииерсиниозные крупного рогатого скота (КРС) к 0:9 сероварианту, позитивные антибруцеллезные КРС (национальная бруцеллезная стандартная) и кроличьи и нормальные сыворотки кролика и КРС в разведении 1:400 в ЗФР+0,5% Твина 20 (ЗФРТ), вносимых на планшету в трех повторностях. Инкубируют 1 ч при комнатной температуре. Далее опыт проводят как описано в примере 1 с момента добавления сыворотки. Результаты представлены в табл. 4.

Как следует из табл. 4 предложенный способ является более чувствительным и специфичным, поскольку все исследованные гипериммунные кроличьи сыворотки, полученные к различным серовариантам иерсиний, дают на корпускулярном иерсиниозном антигене из штамма Y. enterocolitica сероварианта 0:3 положительные результаты (ЕД ИФА>244); ЕД ИФА анти-бруцеллезных сывороток и антисывороток к другим энтеробактериям были отрицательными (<244).

Из данных, приведенных в примерах, можно сделать вывод, что предлагаемая ИФА тест-система имеет ряд преимуществ перед описанными в аналоге и прототипе.

1. Уменьшение трудоемкости исследования в результате использования в качестве антигена целых клеток культур – Y. enterocolitica 0:3, а не очищенных клеточных или внеклеточных субстанций.

2. Сокращение времени сенсибилизации полистирола антигенами.

3. Предлагаемая ИФА-тест-система обладает более широкой сероварспецифичностью при диагностике Y. enterocolitica по сравнению с аналогом и прототипом. Все проверенные в ней гипериммунные сыворотки, полученные к серовариантам 0:3, 0:5, 0:6, 0:7, 0:8 и 0:9 дают на иерсиниозном антигене положительный результат, тогда как ни одна позитивная бруцеллезная, сальмонелезная, шигеллезная или эшерихиозная сыворотки не реагируют на нем положительно.

Формула изобретения

Способ диагностики иерсиниозов, включающий сенсибилизацию полистироловой планшеты антигеном с последующим выявлением антител в сыворотках крови с помощью ферментной метки, отличающийся тем, что в качестве антигена для сенсибилизации полистироловой планшеты используют инактивированный корпускулярный антиген из штамма Y. enterocolitica сероварианта 0:3, в забуференном физиологическом растворе с pH 7,3 с оптической плотностью 0,1 о.е. мутности, устанавливаемой при длине волны 540 нм в кювете толщиной 10 мм, а сенсибилизацию полистироловой планшеты осуществляют путем ее инкубации в течение 15 мин при 37^oC.

РИСУНКИ

MM4A – Досрочное прекращение действия патента СССР или патента Российской Федерации на изобретение из-за неуплаты в установленный срок пошлины за поддержание патента в силе

Дата прекращения действия патента: 19.08.2007

Извещение опубликовано: 10.03.2009 БИ: 07/2009