Патент на изобретение №2237713

(54) ШТАММ ВИРУСА PESTIS SUUM, ИСПОЛЬЗУЕМЫЙ ДЛЯ КОНТРОЛЯ ИММУНОГЕННОЙ И АНТИГЕННОЙ АКТИВНОСТИ ВАКЦИН И ИЗГОТОВЛЕНИЯ БИОПРЕПАРАТОВ ДЛЯ СПЕЦИФИЧЕСКОЙ ПРОФИЛАКТИКИ И ДИАГНОСТИКИ КЛАССИЧЕСКОЙ ЧУМЫ СВИНЕЙ

(57) Реферат:

Изобретение относится к области ветеринарной биотехнологии, вирусологии и микробиологии. Предложенный новый штамм вируса классической чумы свиней (КЧС) получен прямым пассажем на подсвинках вирулентного вируса КЧС. Штамм обладает стабильной инфекционной, антигенной и иммуногенной активностью. Штамм используется для изготовления высокоиммуногенной вакцины против КЧС, получения гипериммунных сывороток для профилактики КЧС и позволяет использовать антиген и полученную на него сыворотку в серологических реакциях для диагностики КЧС. Новый штамм может также использоваться в качестве тест-объекта для анализа качества биопрепаратов.

Предлагаемое изобретение относится к области ветеринарной вирусологии, в частности к новому штамму Pestis suum, используемому для контроля иммуногенной и антигенной активности вакцин, изготовления биопрепаратов для специфической профилактики и диагностики классической чумы свиней (КЧС).

КЧС – тяжелое, часто смертельное, заразное вирусное заболевание свиней, характеризующееся многообразием клинических форм и проявлений, а именно лихорадкой, поражением кровеносной и кроветворной систем (явления геморрагической септицемии), крупозным воспалением легких и крупозно-дифтеритическим воспалением кишечника. Возбудителем заболевания является вирус, принадлежащий к роду Pestivirus семейства Flaviviridae.

В настоящее время КЧС по актуальности занимает одно из первых мест в инфекционной патологии свиней и считается для стран с интенсивной системой свиноводства одной из экономически важных болезней, а в ветеринарно-санитарном плане – одной из наиболее трудно ликвидируемых эпизоотий. За прошедшие годы наблюдалось несколько периодов активизации эпизоотического процесса этой болезни с последующим снижением ее интенсивности. КЧС регистрируется практически во всех экономических регионах России (от Калининграда до Дальнего Востока и от Архангельской области до Краснодарского края). Хотя резервуары и пути передачи и распространения инфекции хорошо известны, практический опыт показывает, что осуществить комплекс защиты страны и хозяйств от заноса возбудителя КЧС, а тем более ликвидировать возникшую эпизоотию чрезвычайно трудно.

Для специфической профилактики свиней применяют живые лапинизированные или культуральные вакцины из аттенуированных штаммов вируса КЧС.

Для контроля иммуногенной активности используемых вакцин и для изготовления инактивированных вакцин против КЧС используют известные вирулентные штаммы Pestivirus suum вируса классической чумы свиней: “Отечественный” и “Ши-Мынь” в России, “Вашингтон” и “Ames” в США, “Альфорт” во Франции, “ALD” в Японии, “Shimen” в Китае (1-7).

Недостатками этих штаммов являются: 1) относительная нестабильность при длительном (3-10 лет) хранении биоматериалов даже при низких температурах, 2) вариабельность по уровню инфекционной активности в биоматериалах (10⁵-10⁷ ЛД₅₀/см³), 3) различная продолжительность инфекционного процесса у зараженных свиней, не иммунных к вирусу КЧС (7-21 сутки).

Целью изобретения является получение нового штамма вируса Pestis suum “Ши-Мынь”, обладающего стабильной биологической и антигенной активностью при длительном хранении, с возможностью его использования для контроля иммуногенной и антигенной активности вакцин и изготовления биопрепаратов для специфической профилактики и диагностики классической чумы свиней.

Новый штамм Pestis suum “Ши-Мынь” получен из выделенного в 1992 году изолята вируса Pestis suum, от больного подсвинка 3-месячного возраста путем последовательных пассажей на свиньях. В 2001 году штамм депонирован в Коллекции микроорганизмов Федерального государственного учреждения “Всероссийский государственный научно-исследовательский институт контроля, стандартизации и сертификации ветеринарных препаратов – Центр качества ветеринарных препаратов и кормов (ФГУ ВГНКИ)” и имеет регистрационный номер “Ши-Мынь-47”-ДЕП.

Штамм Pestis suum “Ши-Мынь-47” ВГНКИ характеризуется следующими признаками и свойствами.

Морфологические свойства.

При электронно-микроскопическом исследовании штамм “Ши-Мынь-47” представлен типичным для пестивирусов отдельными вирионами сферической или округлой формы диаметром 40-44 нм. На ультратонких срезах величина нуклеокапсида определена в 34-38 нм, а толщина липопротеиновой оболочки 3 нм. При биофизическом исследовании вируса его коэффициент седиментации по Сведбергу равен 10418 S, плавучая плотность составляет 1,16-1,20 г/см³.

Генно-инженерными и биохимическими методами установлено, что вирусный геном представляет собой однонитевую плюс-РНК с молекулярной массой 410 Да, состоящую из 12284 нуклеотидов с единственной длинной открытой рамкой считывания, соответствующей полипротеину длиной в 3898 аминокислотных остатков. В составе генома вируса КЧС гены располагаются от Т-конца к С-концу в следующей последовательности: gp44/48-gp33-gp55. Очищенные в градиенте вирионы (электрофорез в ПААГ) содержат 3 основных вида вирусспецифических белков с молекулярной массой 54-55 кДа, 45-47 кДа и 35-37 кДа. Два наиболее крупных по размеру полипептида представляют собой гликопротеины, расположенные на поверхности вириона. Штамм “Ши-Мынь-47” имеет полипептиды (метод радиоиммунной преципитации) E1 (gp55), E2 (gp46) и С (gp36). Полипептид gp55 содержит основные иммунореактивные доминанты, участвующие в нейтрализации инфекционности вируса КЧС.

Культуральные свойства.

Вирус хорошо размножается в перевиваемой культуре клеток почки поросенка (РК-15) и первичных культурах клеток: лейкоцитов свиньи (ЛС), и костного мозга свиней (КМС), и других клетках свиного происхождения. Не вызывает выраженного цитопатического действия (ЦПД) в инфицированных культурах клеток за исключением резкого снижения фагоцитарной активности макрофагов в ЛС. Вирусная инфекция культур клеток обнаруживается при использовании метода флуоресциирующих антител. При культивировании в культурах клеток РК-15 и (ЛС) титр вируса составляет 5-7 lg ККИД/см³.

Оптимальными условиями для выращивания штамма “Ши-Мынь” являются односуточные перевиваемые культуры клеток РК-15 с внесением в поддерживающую среду 5-10% фетальной сыворотки КРС и 5-суточные первичные культуры клеток ЛС и ККМС с внесением в поддерживающую среду 5-10% сыворотки свиней, не содержащих пестивирусные антитела, аутологичных сывороток крови свиней.

Антигенные свойства.

Штамм “Ши-Мынь-47” вируса КЧС при парентеральном введении взрослым свиньям стимулирует образование вируснейтрализующих антител в титрах 1-8 log₂ (реакции нейтрализации флуоресцирующих микробляшек). Вирулентные свойства.

После инъекции штамма “Ши-Мынь” вируса КЧС поросятам в дозе 10-1000000 ЛД₅₀/см³ у 100% привитых животных через 2-6 суток после заражения отмечают повышение температуры тела до 40,1-42,0С, которая удерживается в течение 7-10 суток при наличии симптомокомплекса КЧС (гипертермия, диарея, рвота, цианоз, угнетение, отказ от корма) и гибели всех зараженных животных на 7-21 сутки.

Стабильность.

Штамм “Ши-Мынь-47” вируса КЧС сохраняет стабильную инфекционную и антигенную активность на протяжении 20 последовательных пассажей на свиньях (срок наблюдения по 67-й пассаж).

Серологические свойства.

Штамм “Ши-Мынь-47” вируса КЧС активен в реакции нейтрализации со специфической сывороткой.

Гемагглютинирующие свойства.

Штамм “Ши-Мынь-47” вируса КЧС не агглютинирует эритроциты животных.

Безвредность для лабораторных животных.

Штамм “Ши-Мынь-47” вируса КЧС безвреден для белых мышей, морских свинок и кроликов при внутримышечном, подкожном и ороназальном введении.

Способность штамма к распространению в естественных условиях.

Заражение свиней в окружающей среде происходит алиментарно, аэрогенно, трансплацентарно и через контакт здоровых животных с выделениями больных. Инкубационный период составляет 3-10 дней.

Основные условия хранения.

Штамм “Ши-Мынь-47” вируса КЧС хорошо хранится при минус 50-70С в лиофилизированном виде во флаконах под герметично закрытыми пробками и закатанными металлическими колпачками или в ампулах, запаянных под вакуумом. Титр лиофилизированного вируса за 10 лет хранения в ампулах практически не снижается, а биологическая активность не меняется. Однако хранение нативного вируса в течение 5 лет при минус 10-40С снижает его инфекционную активность.

Дополнительные сведения о штамме.

Свободен от вирусных, бактериальных, микоплазменных и грибных контаминантов.

Изобретение иллюстрируется следующими примерами:

Пример 1

Готовят лиофилизированный вируссодержащий материал из штамма “Ши-Мынь-47” ВГНКИ. Для этого свиньям (не иммунным к пестивирусам и имеющих массу 20-60 кг) внутримышечно вводят суспензию штамма “Ши-Мынь-47” в дозе 10 000 ЛД₅₀ в объеме 1 см³. У животных ежедневно измеряют температуру тела. Свиней, реагирующих через 42-52 ч повышением температуры до 40,5-41,8С, обескровливают тотально на 5-7 сутки. От каждого животного кровь отбирают в отдельный стерильный флакон, содержащий 1000 ЕД гепарина. Затем кровь сливают в одну емкость, перемешивают, отбирают пробу в объеме 10 см³ для контроля титра вируса, охлаждают до температуры 4-8С и, соблюдая стерильные условия, центрифугируют при 3000 об/мин в течение 20 мин для освобождения от оболочек деструктированных эритроцитов и возможных сгустков. Надосадочную жидкость собирают в бутыль и добавляют антибиотики в эффективном количестве. Полученный вируссодержащий материал объединяют со средой высушивания в соотношении, необходимом для получения вируссодержащего биоматериала с заданной инфекционной активностью. В качестве ингредиентов защитной среды используют широко применяемые для этих целей вещества: сахарозу, желатин и гидролизат лактальбумина. Смесь антигена и защитной среды тщательно перемешивают, при необходимости доводят рН смеси до 7,3-7,4, разливают в стерильные флаконы (ампулы) по 1-2 см³ и подвергают лиофильному высушиванию. По окончании сушки флаконы с вакциной закрывают резиновыми пробками и обкатывают алюминиевыми колпачками, обеспечивающими герметичность флаконов.

Ампулы запаивают под вакуумом. Готовый биоматериал представляет собой сухую аморфную массу красно-коричневого цвета, легко растворимую при добавлении физиологического раствора. Вируссодержащий материал из штамма “Ши-Мынь-47” сохраняет свою биологическую активность при хранении в условиях температуры минус 50-70С.

Пример 2

Проверяют иммуногенную активность культуральной сухой вирусвакцины ЛК-ВНИИВВиМ против классической чумы свиней.

Для проверки иммуногенной активности вирусвакцины ЛК-ВНИИВВиМ используют 11 не иммунных к вирусу КЧС подсвинков (масса 20-65 кг). Содержимое пяти флаконов или 10 ампул растворяют в физиологическом растворе (рН 7,0-7,4) до исходного состояния. Готовят 10-кратные разведения вирусвакцины (10^-1-10^-6) на физиологическом растворе (рН 7,0-7,4). Формируют 4 группы животных, из которых первых 3-х иммунизируют внутримышечно культуральной сухой вирусвакциной ЛК-ВНИИВВиМ против КЧС в дозе 1 см³ и разведении 10^-4, 3-х других – в дозе 1 см³ и разведении 10^-5; 3-х подсвинков третьей группы – в дозе 1 см³ и разведении 10^-6, двух контрольных подсвинков не прививают. Через 15 суток после прививки опытных и двух контрольных подсвинков внутримышечно заражают суспензией штамма “Ши-Мынь-47” ВГНКИ вируса КЧС, полученного по примеру 1, в дозе 4,0 lg ЛД₅₀/см³. За зараженными подсвинками наблюдают в течение 14 суток.

Заболели после введения суспензии штамма “Ши-Мынь-47” ВГНКИ вируса КЧС и погибли на 7-12 сутки с характерными признаками КЧС (гипертермия до 42С, угнетение, отказ от корма, цианоз кожи и слизистых, рвота, понос) все контрольные подсвинки и два из трех животных третьей группы. Остальные животные проявили устойчивость к контрольному заражению. Титр иммуногенной активности вирусвакцины составил 10^5,83 ИмД₅₀/см³. Таким образом, вакцина считается иммуногенной и пригодной для практического применения.

Пример 3

Проверяют иммуногенность лапинизированной сухой вирусвакцины из штамма “СИНЛАК” против классической чумы свиней.

Проводят испытание вирусвакцины на 6 подсвинках (2 из них контрольные) массой 25-35 кг в возрасте 60-80 дней, не имеющих в крови пестивирусные антитела. Содержимое пяти флаконов или 10 ампул вирусвакцины, предварительно оттитрованной на кроликах с титром 10⁴ ИД₅₀/см³, растворяют в физиологическом растворе (рН 7,0-7,4) до исходного состояния (2 см³) и затем разводят в 1000 раз.

Каждому из 4 подопытных подсвинков вводят внутримышечно за ухом или с внутренней стороны бедра 2 см³ разведенной вакцины, содержащей 10% прививной дозы, т.е. 10 ИД₅₀/см³ (кроличьих инфекционных доз). Срок наблюдения за привитыми животными составляет 14 суток.

По окончании срока наблюдения всех животных заражают внутримышечно введением суспензии штамма “Ши-Мынь-47” ВГНКИ вируса КЧС аналогично, как в примере 2. Срок наблюдения за зараженными животными – 2 недели. В течение 2-х недель все привитые животные остались здоровыми и живыми, а контрольные погибли от КЧС. Таким образом, вакцина считается иммуногенной и пригодной для практического применения.

Пример 4

Проводят оценку антигенной активности производственного штамма “ЛК-ВНИИВВиМ” вируса классической чумы свиней.

Для этого трех подсвинков 2-3-месячного возраста иммунизируют указанным штаммом в объемной дозе 2 см³ и в разведении 10^-3 (1000 ИмД₅₀/см³). На 22 сутки у всех привитых подсвинков берут пробы крови и получают сыворотки крови. Для определения титра вируснейтрализующих антител к вирусу классической чумы свиней полученную сыворотку исследуют в реакции нейтрализации с 100-1000 ККИД₅₀/см³ штамма “Ши-Мынь-47” ВГНКИ, полученного по примеру 1. Оценку реакции проводят через 2-3 суток в реакции иммунофлуоресценции по наличию в перевиваемой монослойной перевиваемой культуре клеток почки свиньи (РК-15) – “микробляшек”, т.е. групп клеток, пораженных вирусом КЧС и флуоресциирующих изумрудно-зеленым свечением. Контролем служит инфицированная и неинфицированная перевиваемая культура клеток почки поросенка (РК-15). Титр вируснейтрализующих антител в сыворотках крови составляет 1:64-1:1024. Таким образом, производственный штамм “ЛК-ВНИИВВиМ” вируса классической чумы свиней считается иммуногенным.

Пример 5

Готовят инактивированную вакцину против КЧС из штамма “Ши-Мынь-47” ВГНКИ (тканевой или культуральный варианты вакцины). Полученный по примеру 1, вируссодержащий материал растворяют на физиологическом растворе с рН 7,2-7,4, титруют в культуре ЛС, доводят титр вируса до 7 lg ККИД₅₀/см³ (тканевой вариант). Вируссодержащий материал для культурального варианта вакцины получают общепринятыми методами в монослойных и роллерных 5-7-суточных первичных культурах клеток лейкоцитов и клеток костного мозга свиней (культуральный вариант вакцины). Титр вируссодержащего материала в культуре ЛС составляет 7,0-8,5 lg ККИД₅₀/см³.

Затем для инактивации в вируссодержащий материал вносят 10-кратный концентрат раствора препарата А₂₄ (5 мг/см³) в объемном соотношении 10:1 и проводят инкубацию при 37С в течение 6-12 часов. Расчет количества времени, необходимого для инактивации, определяют по формуле

Т=1,54х-4,51

где Т – время в часах, х – титр вируссодержащего материала, 1,54 и 4,51 – постоянные коэффициенты.

В инактивированный препарат добавляют 50% гидроокиси алюминия (ГОА) и выдерживают 30 минут. Готовую вакцину стерильно фасуют во флаконы по 100-200 см³, закрывают резиновыми пробками и обкатывают алюминиевыми колпачками, обеспечивающими герметичность флаконов, проверяют ее активность в соответствии с примером 4. Готовый биопрепарат представляет собой антигенсодержащую суспензию серого цвета. Вакцина сохраняет свою иммуногенную активность в течение 1 года при хранении в условиях температуры 2-8С.

Пример 6

Полученную по примеру 7 инактивированную вакцину из штамма “Ши-Мынь-47” ВГНКИ используют для иммунизации пяти подсвинков 3-месячного возраста. Для этого полученную вакцину вводят двукратно с интервалом в 14 суток подкожно в области уха в дозе 4 см³. У животных на 21-й день после 2-й прививки берут пробы крови, получают сыворотки и в реакции нейтрализации определяют титры антител в соответствии с примером 4. У всех иммунизированных животных устанавливают титры вируснейтрализующих антител в диапазоне от 1:16 до 1:128. Таким образом, полученная вакцина является иммуногенной и пригодной для практического применения.

Пример 7

Проверяют иммуногенную активность инактивированной вакцины против классической чумы свиней, приготовленной по примеру 5.

Для проверки иммуногенной активности вакцины используют 4 не иммунных к вирусу КЧС подсвинков (масса 20-65 кг). Содержимое 3 флаконов смешивают и иммунизируют 3 подсвинков внутримышечно в дозе 4 см³ двукратно с интервалом 14 суток. Контрольного подсвинка не прививают. После второй иммунизации (через 21 день) опытных и контрольного подсвинков внутримышечно заражают предварительно приготовленной суспензией штамма “Ши-Мынь-47” ВГНКИ вируса КЧС, полученного по примеру 1, в дозе 3,0 lg ЛД₅₀/см³. За зараженными подсвинками наблюдают в течение 14 суток.

Контрольный подсвинок заболел после введения вируссодержащей суспензии и погиб на 12 сутки с характерными признаками болезни КЧС. Остальные животные проявили устойчивость к контрольному заражению. Таким образом, инактивированная вакцина считается иммуногенной и пригодной для практического использования.

Пример 8

Получают гипериммунную сыворотку из штамма “Ши-Мынь-47” ВГНКИ для диагностических и профилактических целей. Для этого двух, не иммунных к вирусу КЧС подсвинков массой 50-60 кг иммунизируют подкожно инактивированной вакциной против КЧС из штамма “Ши-Мынь-47” ВГНКИ, полученную в соответствии с примером 5, в дозе 4 см³. Через 10 суток иммунизированных подсвинков заражают внутримышечно суспензией штамма “Ши-Мынь-47” ВГНКИ, полученного по примеру 1, в дозе 6,0 lg ЛД₅₀/см³. Гипериммунную сыворотку получают от переболевших подсвинков через 45-70 суток. Сыворотку крови получают общепринятым методом. Устанавливают титр полученной сыворотки в реакции нейтрализации при помощи перевиваемой культуры клеток почки поросенка (РК-15) и метода прямой иммунофлуоресценции, который составляет 1:2569-1:10240.

Готовая гипериммунная сыворотка представляет собой прозрачную жидкость желтого цвета. Полученную сыворотку разливают в стерильные флаконы по 4-200 см³, закрывают резиновыми пробками и обкатывают алюминиевыми колпачками, обеспечивающими герметичность флаконов, и хранят в нативном состоянии при температуре 4С в течение 12 месяцев.

Пример 9

Полученную по примеру 8 гипериммунную сыворотку применяют 10 поросятам 1,5-3-месячного возраста. Сыворотку вводят однократно, подкожно за ухом, в дозе 5-10 см³. На 1-15 сутки животных заражают предварительно приготовленной суспензией штамма “Ши-Мынь-47” ВГНКИ вируса КЧС, полученной по примеру 1, в дозе 4,0 lg ЛД₅₀/см³. За животными наблюдают в течение 14 суток после заражения. У всех животных не отмечают отклонений от нормального физиологического состояния, что подтверждает высокую эффективность полученного биопрепарата.

Пример 10

Готовят специфический ФИТЦ-иммуноглобулин (флуоресцирующие антитела к вирусу классической чумы свиней) для диагностических целей.

Получают гипериммунную сыворотку против КЧС из штамма “Ши-Мынь-47” ВГНКИ в соответствии с примером 8. Выделение глобулиновой фракции из нативных гипериммунных сывороток подсвинков проводят общепринятым методом при 40%-ном насыщении сернокислым аммонием. Из общей фракции глобулинов на колонке с ДЭАЭ-целлюлозой выделяют фракцию иммуноглобулинов. Метку иммуноглобулинов проводят по модифицированной методике Маршалла флуоресцеином изотиоцианата (ФИТЦ) – флуорохромом, флуоресциирующим зеленым цветом.

Для этого в течение 24 часов при температуре 2-4С осуществляют конъюгирование иммуноглобулинов с ФИТЦ в соотношении 1:50 (флуорохром/белок). Очистку конъюгата от несвязавшегося флуорохрома проводят гельфильтрацией через колонку с сефадексом G-50, элюцию – 0,14 М фосфатным буферным раствором с рН 7,5, собирая фракции по 10-15 см³. При гельфильтрации раствор ФИТЦ-иммуноглобулина разбавляют до 0,5%-ного содержания белка. Концентрацию белка определяют при помощи спектрофотометра по формуле на основании измерения светопоглощения конъюгата при длине волны 280 и 495 нм. Степень очистки конъюгата от несвязавшегося флуорохрома проводят методом восходящей хроматографии на бумаге. Для устранения неспецифического свечения конъюгаты обрабатывают порошками печени не иммунной к ВКЧС свиньи (50-100 мг на 1 мг белка) и неинфицированной перевиваемой культуры клеток почки поросенка (РК-15) – 10-20 мг на 1 мг белка.

Флуоресцирующие иммуноглобулины проверяют на специфичность и активность в прямой и непрямой реакциях иммунофлуоресценции. Красящий титр ФИТЦ-иммуноглобулина составил 1:16. Неспецифическое свечение в контрольных препаратах отсутствовало. Протестированную серию ФИТЦ-иммуноглобулина с активностью 1:16 разливают в ампулы по 1 см³, лиофилизируют. Запаянные ампулы хранят в темном месте при температуре 4С в течение 24 месяцев и используют для постановки реакции прямой иммунофлуоресценции.

Использование в ветеринарной практике штамма Pestis suum “Ши-Мынь-47” ВГНКИ позволит с достаточной достоверностью судить о качестве изготавливаемых и используемых биопрепаратов против классической чумы свиней, изготавливать на его основе высокоиммуногенную вакцину против КЧС, получать гипериммунные сыворотки на подсвинках для профилактики классической чумы свиней. Использовать антиген и полученную на него сыворотку в серологических реакциях для диагностики классической чумы свиней.

Формула изобретения

Штамм вируса Pestis suum ВГНКИ “Ши-Мынь-47 ДЕП”, используемый для контроля иммуногенной и антигенной активности вакцин и изготовления биопрепаратов для специфической профилактики и диагностики классической чумы свиней.