Патент на изобретение №2237712
|
||||||||||||||||||||||||||
(54) СРЕДА ДЛЯ КРИОКОНСЕРВАЦИИ КЛЕТОК ЧЕЛОВЕКА И ЖИВОТНЫХ
(57) Реферат:
Изобретение относится к биотехнологии и медицине, конкретно к средам для криоконсервации клеток человека и животных. Среда содержит эмбриональную телячью сыворотку, диметилсульфоксид, среду RPMI-1640, антибиотики, ацетоамид, D-глюкуроновую кислоту, лецитин, холестерин, линолевую кислоту в заданном соотношении компонентов. Изобретение обеспечивает повышение выживаемости клеток за счет усиления их устойчивости к криоконсервации и снижение токсического действия криопротектора. 2 табл. Изобретение относится к биологии и медицине, конкретно к средам для криконсервации клеток человека и животных. Известны среды для криоконсервации клеток человека и животных, содержащие солевую основу, криопротектор, пируват, лактат, глюкозу, антибиотики, сульфаниламиды, бычий сывороточный альбумин, феноловый красный, хепес-буфер, например модифицированные среды М 1 и М 2 [1]. Однако данные среды не содержат аминокислоты, витамины, сыворотку, которые необходимы для адаптации и защиты клеток при проведении процедуры криоконсервации. Это приводит к нежелательному повреждению и гибели клеток в процессе криоконсервации при замораживании и оттаивании. Наиболее близкой по составу к предлагаемой среде является среда, которая наряду с солевой основой, криопротектором, пируватом, лактатом, глюкозой, антибиотиками и сульфаниламидами, дополнительно содержит аминокислоты, витамины и сыворотку, например среда RPMI-1640 с добавлением 10-20% эмбриональной телячьей сыворотки, 5-10% диметилсульфоксида, 100 МЕ/мл пенициллина натриевой соли и 100 мкг/мд стрептомицина сульфата [6]. Данная среда благодаря наличию аминокислот, витаминов и сыворотки способствует защите и адаптации клеток к условиям криоконсервации. Однако она не содержит стабилизаторы клеточных мембран и коллоидных структур, которые повышают устойчивость клетки к замораживанию. В ней отсутствуют вещества, снижающие токсическое действие криопротектора (диметилсульфоксида) на клетки. Новая техническая задача – повышение выживаемости клеток за счет усиления устойчивости клеток к криоконсервации и снижение токсического действия криопротектора. Поставленную задачу решают применением новой среды, содержащей среду RPMI-1640, эмбриональную телячью сыворотку, диметилсульфоксид, антибиотики и сульфаниламиды, причем она дополнительно содержит ацетамид, D-глюкуроновую кислоту, лецитин, холестерин и линолевую кислоту при следующем соотношении компонентов, об.%: Эмбриональная телячья сыворотка 10-20 Диметилсульфоксид 5-15 Ацетоамид 10-30 D-глюкуроновая кислота 0,01-0,03 Лецитин 0,05-0,15 Холестерин 0,05-0,15 Линолевая кислота 0,025-0,075 Сульфаниламиды и антибиотики 0,1-1,5 Среда RPMI-1640 До 100 Отличие прилагаемого изобретения от известных аналогов заключается в том, что среда дополнительно содержит ацетоамид, D-глюкуроновую кислоту, лецитин, холестерин, линолевую кислоту при следующем соотношении компонентов, об.%: Эмбриональная телячья сыворотка 10-20 Диметилсульфоксид 5-15 Ацетоамид 10-30 D-глюкуроновая кислота 0,01-0,03 Лецитин 0,05-0,15 Холестерин 0,05-0,15 Линолевая кислота 0,025-0,075 Сульфаниламиды и антибиотики 0,1-1,5 Среда RPMI-1640 До 100 Сравнение заявляемого технического решения с другими показывает, что предлагается композиция ингредиентов среды для криоконсервации клеток человека и животных, позволяющая повысить выживаемость клеток при криоконсервации, описание состава которой не обнаружено в литературных источниках. С учетом изложенного, следует считать заявляемое решение соответствующее критерию “существенные отличия”. Применение данной среды в эксперименте на клетках животных и человека показало, что она “промышленно применима” при проведении процедуры криоконсервации. Технология приготовления среды включает следующие операции: – приготовление липосом с помощью ультразвука по стандартной методике из 1 части (по весу) холестерина, 5 частей линолевой кислоты, 10 частей лецитина [4]; – смешивание липосом со средой RPMI-1640, эмбриональной телячьей сывороткой, D-глюкуроновой кислотой, пенициллином и стрептомицином до полного растворения веществ; – добавление (непосредственно перед употреблением) в среду диметилсульфоксида и охлаждение ее до комнатной температуры. Полученная среда содержит, об.%: Эмбриональная телячья сыворотка 10-20 Диметилсульфоксид 5-15 Ацетоамид 10-30 D-глюкуро новая кислота 0,01-0,03 Лецитин 0,05-0,15 Холестерин 0,05-0,15 Линолевая кислота 0,025-0,075 Сульфаниламиды и антибиотики 0,1-1,5 Среда RPMI-1640 До 100 Концентрации компонентов в предлагаемой среде для криоконсервации клеток человека и животных подобраны на основании интерпретации данных экспериментальных исследований. В связи с тем, что основное повреждающее действие на клетки при криоконсервации оказывает криопротектор диметилсульфоксид было решено, чтобы в среде для сравнения (прототип) концентрация криопротектора и эмбриональной телячьей сыворотки (стабилизатора клеточных мембран) в каждом из экспериментов соответствовала их содержанию в предлагаемой среде. Поэтому концентрации указанных компонентов в среде-прототипе соответственно находились в пределах, об.%: диметисульфоксид 5-15, эмбриональная телячья сыворотка 10-20. Антибиотики и сульфаниламиды применяли в общепринятых дозировках (пенициллин натриевая соль 100 МЕ/мл, стрептомицина сульфат 100 мкг/мл), составляло 0,1-1,5 об.%. Пример 1 Кардиомиоциты выделяли из сердца новорожденных крысят породы “Вистар” с помощью ферментов [8]. Жизнеспособность (выживаемость), клеточность и морфологию клеток определяли по общепринятьм методам с использованием трипанового синего, гемоцитометра и окраски азур-II эозином соответственно [3, 5]. Доводили концентрацию клеток до 1 Эмбриональная телячья сыворотка – 10 Диметилсульфоксид 5 Ацетоамид 10 D-глюкуроповая кислота 0,01 Лецитин 0,05 Холестерин 0,05 Линолевая кислота 0,025 Пенициллин натриевая соль 100 МЕ/мл Стрептомицина сульфат 100 мкг/мл Среда RPMI-1640 До 100 Материал перемешивали и помещали в контейнеры для криоконсервации по 1,5 мл и замораживали по двухступенчатой схеме. Первоначально охлаждали до -40 В контроле использовали среду-прототип, содержащую, об.%: Среда RPMI-1640 85 Эмбриональная телячья сыворотка 10 Диметилсульфоксид 5 Результаты представлены в таблице 1. Анализ показал, что количество жизнеспособных клеток (выживаемость) после размораживания в представленной среде через 1 год (опыт 54,7 Пример 2 Кардиомиоциты выделяли из сердца новорожденных крысят породы “Вистар” с помощью ферментов [8]. Жизнеспособность (выживаемость), клеточность и морфологию клеток определяли по общепринятым методам с использованием трипанового синего, гемоцитометра и окраски азур-II эозином соответственно [3, 5]. Доводили концентрацию клеток до 1 Эмбриональная телячья сыворотка 15 Диметилсульфоксид 10 Ацетоамид 20 D-глюкуроновая кислота 0,02 Лецитин 0,1 Холестерин 0,01 Линолевая кислота 0,05 Пенициллин натриевая соль 100 МЕ/мл Стрептомицина сульфат 100 мкг/мл Среда RPMI-1640 До 100 Материал перемешивали и помещали в контейнеры для криоконсервации по 1,5 мл и замораживали по двухступенчатой схеме. Первоначально охлаждали до -40 Среда RPMI-1640 75 Эмбриональная телячья сыворотка 15 Диметилсульфоксид 10 Пенициллин натриевая соль 100 МЕ/мл Стрептомицина сульфат 100 мкг/мл Результаты представлены в таблице 1. Анализ показал, что количество жизнеспособных клеток (выживаемость) после размораживания в представленной среде через 1 год (опыт 67,1 Пример 3 Кардиомиоциты выделяли из сердца новорожденных крысят породы “Вистар” с помощью ферментов [8]. Жизнеспособность (выживаемость), клеточность и морфологию клеток определяли по общепринятым методам с использованием трипанового синего, гемоцитометра и окраски азур-II эозином соответственно [3, 5]. Доводили концентрацию клеток до 1 Эмбриональная телячья сыворотка 20 Диметилсульфоксид 15 Ацетоамид 30 D-глюкуроновая кислота 0,03 Лецитин 0,15 Холестерин 0,015 Линолевая кислота 0,075 Пенициллин натриевая соль 100 МЕ/мл Стрептомицина сульфат 100 мкг/мл Среда RPMI-1640 До 100 Материал перемешивали и помещали в контейнеры для криоконсервации по 1,5 мл и замораживали по двухступенчатой схеме. Первоначально охлаждали до -40 Среда RPMI-1640 75 Эмбриональная телячья сыворотка 20 Диметилсульфоксид 15 Пенициллин натриевая соль 100 МЕ/мл Стрептомицина сульфат 100 мкг/мл Результаты представлены в таблице 1. Анализ показал, что количество жизнеспособных клеток (выживаемость) после размораживания в представленной среде через 1 год (опыт 56,1 Пример 4 10 мл Периферической крови человека, стабилизированной гепарином (100 ЕД/мл), осторожно наслаивали на 5 мл раствора фиколлгипака с плотностью 1,077 г/см3. Центрифугировали при 3000 об/мин в течение 15-20 мин. Интерфазный слой содержащий моноциты и лимфоциты собирали и отмывали от фиколлгипака свежей порцией среды RPMI-1640 с 10% эмбриональной телячьей сывороткой. Клеточность жизнеспособных мононуклеаров доводили до 1 Эмбриональная телячья сыворотка 15 Диметилсульфоксид 10 Ацетоамид 20 D-глюкуроновая кислота 0,02 Лецитин 0,1 Холестерин 0,01 Линолевая кислота 0,05 Пенициллин натриевая соль 100 МЕ/мл Стрептомицина сульфат 100 мкг/мл Среда RPMI-1640 До 100 И замораживали в жидком азоте, как было описано выше. В контроле использовали среду прототипа, состоящую, об.%: Среда RPMI-1640 75 Эмбриональная телячья сыворотка 15 Диметилсульфоксид 10 Пенициллин натриевая соль 100 МЕ/мл Стрептомицина сульфат 100 мкг/мл Через год клетки размораживали и оценивали их выживаемость (жизнеспособность) с помощью трипанового синего, с последующим морфологическим анализом. Результаты представлены и таблице 1. Анализ показал, что количество жизнеспособных клеток (выживаемость) после размораживания в представленной среде через 1 год (опыт 85,7 Обоснование выбора ингредиентов Повреждение и гибель клеток при консервации происходит главным образом за счет интрацеллюлярного образования кристаллов льда, которые разрывают мембраны клеток, а также токсического действия криопротектора (диметилсульфоксида) [5]. Диетилсульфоксид по своей эффективности в настоящее время считается одним из лучших крипротекторов среди известных аналогов (глицерин, метанол, сахароза, пропиленгликоль, полиэтиленгликоль и др.). Для снижения его токсического действия в среду вводят ацетоамид, применение которого основано на способности некоторых амидов снижать химическую активность растворов диметилсульфоксида [5]. С целью повышения устойчивости клеточных мембран к криоконсервации в нее добавляют: d-глукуроновую кислоту, лецитин, холестерин и линолевую кислоту. D-глукуроновая кислота входит в состав гликозаминогликанов, образующих внутриклеточные коллоиды, связывающих воду, а также трансмембранные белки. Линолевая кислота и холестерин являются частью липидного, а лецитин – белкового слоев клеточных мембран. Эти вещества выполняют защитную, пластическую и антиоксидантную функции, которые страдают в процессе проведения криоконсервации [5, 7, 9]. Таким образом, применение предлагаемой среды для криоконсервации клеток человека и животных позволяет увеличить выживаемость клеток за счет усиления их устойчивости к криоконсервации и снижения токсического действия криопротектора (диметилсульфоксида). Список используемой литературы 1. Биология развития млекопитающих. Методы/ М.Манк. – М.: Мир, 1990. 2. Гольдберг Е.Д., Дыгай А.М., Шахов В.П. Методы культуры ткани в гематологии, Томск, ТГУ, 1992. 3. Иммунологические методы/ Г.Фримель. – М.: Медицина, 1987. 4. Иммунологические методы исследований/ И.Мерковится, Б.Перниса. – М.: Мир, 1988. 5. Культура животных клеток. Методы/ Р.Фрешни. – М.: Мир. – 1989. 6. Лимфоциты: Методы/Дж.Клаус. – М.: Мир. – 1990, с.239-242. 7. Серов В.В., Шехтер А.Б. Соединительная ткань. – М.: Медицина. – 1981. 8. Физиология и патология сердца/ Н.Сперелаксис. – М.: Медицина. – В2, т.2. – 1990. 9. Юшков Б.Г., Попов Г.К., Северин М.В., Ястребов А.П. Гликопротеины и гемопоэз. – Екатеринбург. – 1994. Формула изобретения
Среда для криоконсервации клеток человека и животных, содержащая среду RPMI-1640, эмбриональную телячью сыворотку, диметилсульфоксид, пенициллин и стрептомицин, отличающаяся тем, что дополнительно содержит ацетоамид, D-глюкуроновую кислоту, лецитин, холестерин, линолевую кислоту при следующем соотношении компонентов об.%: Эмбриональная телячья сыворотка 10-20 Диметилсульфоксид 5-15 Ацетоамид 10-30 D-глюкуроновая кислота 0,01-0,03 Лецитин 0,05-0,15 Холестерин 0,05-0,15 Линолевая кислота 0,025-0,075 Стрептомицин 100 мкг/мл Пенициллин 100 МЕ/мл Среда RPMI-1640 До 100 MM4A Досрочное прекращение действия патента Российской Федерации на изобретение из-за неуплаты в установленный срок пошлины за поддержание патента в силе
Дата прекращения действия патента: 07.05.2004
Извещение опубликовано: 20.11.2005 БИ: 32/2005
NF4A Восстановление действия патента Российской Федерации на изобретение
Извещение опубликовано: 27.01.2006 БИ: 03/2006
MM4A – Досрочное прекращение действия патента СССР или патента Российской Федерации на изобретение из-за неуплаты в установленный срок пошлины за поддержание патента в силе
Дата прекращения действия патента: 07.05.2006
Извещение опубликовано: 10.04.2008 БИ: 10/2008
|
||||||||||||||||||||||||||
107/мл средой следующего состава: среда RPMI-1640 – 80%, эмбриональная телячья сыворотка – 20%). К 1 мл клеточной суспензии по каплям добавляли среду для криоконсервации содержащую, об.%:
С со скоростью 1-2
2,2, прототип 42,5
