Патент на изобретение №2237087

(54) ШТАММ CYLINDROCARPON RADICICOLA – ПРОДУЦЕНТ КОМПЛЕКСА БИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНЫХ ВЕЩЕСТВ, ОБЛАДАЮЩИХ РОСТРЕГУЛЯТОРНЫМИ СВОЙСТВАМИ

(57) Реферат:

Изобретение относится к микробиологической промышленности. Штамм гриба Cylindrocarpon radicicola, хранящийся во Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов, коллекционный номер ВКПМ F-861, является продуцентом комплекса биологически активных веществ, обладающих рострегуляторными свойствами. Изобретение позволяет получить препарат, используемый в качестве биостимулятора роста растений. 3 табл.

Изобретение относится к микробиологической промышленности и касается новой культуры микроорганизмов, продуцирующей биологически активные вещества, обладающие рострегуляторными свойствами, которые могут быть использованы в сельском хозяйстве при обработке таких культур как картофель, огурцы, томаты и др.

Известно сообщество микроорганизмов для получения регуляторов роста растений, состоящее из микромицета Acremonium panaxeorum UHMU F-160, дрожжей Candida muscorum UHMU Y-411, Rhodotorula glutinis UHMU Y-42 и бактерий Azomonas macrocytogenes UHMU B-28 и Xantobacter sp UHMU B-29 /пат. РФ 2100932/. Недостатком указанного сообщества является сложность и трудоемкость его культивирования, нестабильность полученного препарата.

Известны препараты, стимулирующие развитие и рост растений, полученные из чистых культур грибов-эндофитов, выделенных из корней пшеницы, овса, картофеля, пырея, мать-и-мачихи. Каждый препарат состоит из растворенных в 70% этиловом спирте продуктов метаболизма соответствующего ему эндофита. Обработка одним из указанных препаратом семян пшеницы, огурцов или клубней картофеля перед посевом способствовала повышению урожая /Гельцер Ф.Ю. Новые продуценты стимулирующих веществ для растений. Доклады ВАСХНИЛ, №5, 1975/.

Известен препарат “Симбионт-2”, стимулирующий урожайность растений, полученный из продуктов метаболизма грибов-эндофитов (авт.св. СССР №921488). В качестве сырья для его изготовления используют эндофиты, выделенные из корней облепихи.

Недостатком известных стимуляторов роста является невысокая активность препаратов, полученных из эндофитов растений, обладающих наибольшей лекарственной ценностью.

Известен препарат Симбионт-1, изготавливающийся из эндофитов, выделенных из корней женьшеня. Препарат эффективен только при хороших условиях роста растений (авт.св. СССР №370932).

Общим недостатком известных препаратов является невозможность идентифицировать получаемую с помощью известных штаммов продукцию, содержание значительных количеств спирта в препарате.

Наиболее близким техническим решением к заявляемому изобретению является известный штамм Cylindrocarpon magntsianum, являющийся продуцентом регулятора роста растений /патент Украины №17558/. Штамм выделен из корневой системы облепихи. В качестве питательной среды используют, г/л: глюкозу, КН₂РО₄, К₂НРО₄, MgSО₄, К₂SО₄, MnSО₄, FeSО₄, аспарагин. Основным его недостатком является сложность его получения в промышленном масштабе, штамм оказывает эффективность только в прикорневой зоне определенного растения-хозяина.

Целью изобретения является расширение источников сырья из новых штаммов и повышение активности регулятора роста.

Цель достигается тем, что из корней женьшеня выделен новый штамм Cylindrocarpon radicicola. Штамм хранится в Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов, коллекционный номер ВКПМ F-861 (справка о депонировании прилагается). Штамм предназначен для получения биостимулятора роста растений.

Штамм выделен из корней женьшеня. Видовое название культуры Cylindrocarpon radicicola Wollenweber, наименование штамм НТН-10. Родословная штамма: природный изолят.

Культурально-морфологические особенности штамма: аэроб, воздушный мицелий клочковатый, желтовато-белый, колонии с обратной стороны охряного цвета. Макроконидии цилиндрические, на верхушках закругленные (20-454-7 мкм), обычно с тремя поперечными перегородками, образуются на верхушках боковые ответвления конидиеносцев, где собраны ложные головки. Микроконидии шаровидные (3-3,5 мкм) в диаметре. Хламидоспоры промежуточные (интеркалярные), шаровидные, многочисленные, в цепочках, коричневые, 10-16 мкм в диаметре.

Продукт, синтезируемый штаммом, – комплекс биологически активных веществ.

При культивировании штамма в течение трех недель в жидкой среде Гельцер с последующим выделением комплекса вторичных метаболитов полученный препарат дает прирост гипокотиля экспериментальной линии горчицы 30-60% к контролю (воде).

Биологическую активность определяли, используя стандартную методику биотестов на семенах растений.

Штамм хранили на агаризованных питательных средах при температуре 4-7С с пересевами один раз в 3 месяца.

Агаризованная среда Гельцер (ГА), г/л, рН 6,2-6,6:

Глюкоза 8,0

КН₂РO₄ 0,6

К₂НРO₄ 1,8

MgSO₄ 0,2

К₂SO₄ 0,1

MnSO₄ Следы

FeSO₄ Следы

L-аспарагин 0,02

Агар-агар 15,0

Вода До 1000 мл

Размножение культуры осуществляли путем пересева на агаризованной среде Гельцер, состав которой представлен выше.

Условия и состав среды для ферментации: на жидкой питательной среде Гельцер продолжительность культивирования 20-30 дней при температуре 261С. Состав среды: жидкая питательная среда Гельцер, г/л, рН 6,0-6,4:

Глюкоза 8,0

КН₂РO₄ 0,6

К₂НРO₄ 1,8

MgSO₄ 0,2

K₂SO₄ 0,1

MnSO₄ Следы

FeSO₄ Следы

L-аспарагин 0,02

Вода До 1000 мл

Штамм не является зоопатогенным, не является фитопатогенным, не представляет опасности для окружающей среды.

Препарат на основе штамма НТН-10 получили при выращивании культуры в колбах. Культивирование в колбах проводили в два этапа, после первого цикла отбирали культуральную жидкость, добавляли свежую питательную среду в количестве 30% от первоначального объема и осуществляли второй цикл культивирования. При проведении биотестов и химических анализов использовали лиофильно высушенный фильтрат культуральной жидкости.

Содержание фитогормонов в препарате: индолилуксусная кислота (ИУК), цитокинины (ЦК), гибберелины (ГА) определяли хроматографическим методом.

Цитокинины представляют собой наиболее активные природные соединения, участвующие в гормональной регуляции онтогенеза растений и характеризующиеся способностью индуцировать деление растительных клеток.

Гибберелловая кислота ГА₃ наиболее широко применяется в сельском хозяйстве как регулятор роста растений. Однако ГА₇ представляет наибольший интерес, т.к. имеет более широкий спектр действия и физиологическую активность выше.

Индоуксусная кислота (ИУК) является ростстимулятором, но из-за плохой растворимости в воде и относительно высокой стоимости имеет узкий спектр рекомендованных для обработки культур.

Все эти соединения, относящиеся к известным регуляторам роста растений, подробно описаны в литературе /Регуляторы роста растений. Под редакцией Г.С.Муровцева, М., 1979 г./.

Заявляемый штамм позволил получить одновременно все эти соединения, что значительно повысило биологическую активность препарата и одновременно повысило экономическую эффективность его применения.

Биологическая активность сухого препарата на основе заявляемого штамма на мятлике, сорт Деним (контроль – вода) и содержание фитогормонов в этом препарате приведены в таблице 1.

В таблице 2 приведен элементный состав лиофилизированного препарата.

Анализ элементного состава показал, что препарат почти не содержит тяжелых металлов. В препарате по сравнению с питательной средой значительно увеличивается содержание калия и молибдена, содержание остальных элементов уменьшается.

Содержание свободных углеводов, мг/г сух. веса: сахароза – 183; глюкоза – 366; фруктоза – 89; маннит – 102.

В препарате содержатся следующие аминокислоты: лизин – 0,0063; гистидин – 0,0500; аспарагин – 0,0341; серин – 0,0050; глутамин – 0,011; глицин – 0,0340; аланин – 0,570; валин – 0,0500. Аминокислоты определяли методом ионнообменной хроматографии.

В препарате содержатся жирные кислоты, в том числе арахидоновая кислота, которая является важным компонентом комплекса метаболитов, стимулирующая рост и развитие растений. Содержание жирных кислот определяли методом газожидкостной хроматографии.

В препарате также содержится аскорбиновая кислота и цитрин (витамин Р). Определялись методом цветных реакций.

Данные по химическому составу препарата, мг/г сух. веса: фитогормоны – 19,034; аминокислоты – 0,543; углеводы – 743,000; зольные элементы – 24,737.

Полученный биостимулятор осаждают этанолом, ацетоном, термоустойчив до 150С, характеризуется биологической стабильностью, устойчив к воздействию микроорганизмов.

Изобретение характеризуется следующим примером.

Пример 1

Штамм Cylindrocarpon radicicola растет на богатой органической среде (жидком сусле) в условиях аэрации при 20-30С, в течение 48 часов продуцирует 25 г вторметаболитов, проявляющих биостимулирующую активность. Культивирование штамма осуществляют на жидкой питательной среде Гельцер, продолжительность культивирования 20-30 дней при температуре 261°С.

Состав среды: жидкая питательная среда Гельцер, г/л, рН 6,0-6,4:

Глюкоза 8,0

КН₂РO₄ 0,6

К₂НРO₄ 1,8

MgSO₄ 0,2

К₂SO₄ 0,1

MnSO₄ Следы

FeSO₄ Следы

L-аспарагин 0,02

Вода До 1000 мл

В качестве источника углеродного питания использовали глюкозу в концентрации 1,5 или 2,5 вес.%.

При культивировании на жидкой питательной среде заявляемый штамм требует дополнительный фактор роста – ферментализат БВК в количестве 0,2%. Выращивание осуществляют при 28-30С, в условиях аэрации и перемешивании в колбах объемом 750 мм³ со 100 мл среды указанного состава в течение 48 ч на качалках (220 об/мин). При этом происходит подкисление среды до рН 4,7 за счет выделения органических кислот и СО в культуральную жидкость. Было установлено оптимальное значение рН для роста культуры Cylindrocarpon radicicola 6,8-7,0 и для синтеза метаболитов – 6,8-7,2.

Исследовали процесс синтеза метоболитов заявляемым штаммом в интервале температур 25-35С. Для достижения необходимого значения рН приводили подтитровку 10%-ным раствором NaOH. Концентрация глюкозы 2,5 вес.%.

Процесс идет стабильно, штамм устойчиво сохраняет свойство синтезировать метаболиты в пяти последовательных ферментациях.

Метаболиты, состав которых указан в таблице 1, синтезируемые заявляемым штаммом, использовали при обработке посевов зерновых, сахарной свеклы, картофеля, томатов, огурцов, саженцев красной смородины, крыжовника.

Полученный жидкий препарат на основе заявляемого штамма осторожно перемешивали и применяли для обработки (внесение в почву) посадок сеянцев ели (внекорневая подкормка), картофеля (полив всходов), капусты поздней (подкормка рассады накануне высадки в грунт), томаты (внекорневая подкормка), огурцы (полив всходов). Вели морфофизиологические и фенологические наблюдения, учитывали урожай продукции, определяли некоторые параметры, характеризующие качество продукции. Результаты отдельных испытаний приведены в таблице 3. Контроль (100%) – показатели продукции с участка, необрабатываемых заявляемым штаммом.

Заявляемый штамм осуществляет положительное влияние на растения посредством прямой и непосредственной стимуляции роста растений за счет синтеза различных метаболитов, полезных для растений. Препарат, изготовленный на основе заявляемого штамма, найдет широкое применение в современной агробиотехнологии.

Вторметаболиты, состав которых указан в таблице 1, синтезируемые заявляемым штаммом, использовали также при обработке посевов зерновых как путем обработки семян, так и опрыскивания растений по всходам. Кроме того, положительный результат получен при обработке посевов подсолнечника, сахарной свеклы, гречихи. Урожайность по этим культурам повысилась в среднем на 32-34%.

Заявляемый штамм при проведении патентного и информационного поиска на уровне техники не обнаружен, в связи с чем можно сделать вывод о соответствии заявляемого изобретения условиям патентоспособности, предусмотренной Патентным законом РФ.

Формула изобретения

Штамм гриба Cylindrocarpon radicicola – продуцент комплекса биологически активных веществ, обладающих рострегуляторными свойствами, коллекционный номер ВКПМ F-861.

PC4A – Регистрация договора об уступке патента Российской Федерации на изобретение

(73) Патентообладатель(и):

Власов Сергей Александрович

(73) Патентообладатель:

Автономная некоммерческая организация “Научно-техническое объединение “ИТИН”

Дата и номер государственной регистрации перехода исключительного права: 27.06.2005 № 21181

Извещение опубликовано: 10.08.2005 БИ: 22/2005