Патент на изобретение №2236455

(54) ШТАММ БАКТЕРИЙ VIBRIO CHOLERAE КМ 168 – ОСНОВА ДЛЯ КОНСТРУИРОВАНИЯ ЖИВЫХ ВАКЦИН ПРОТИВ ДИАРЕЙНЫХ ЗАБОЛЕВАНИЙ, ВЫЗЫВАЕМЫХ ПАТОГЕННЫМИ ШТАММАМИ V. CHOLERAE О139

(57) Реферат:

Изобретение относится к биотехнологии. Штамм V. cholerae О139 получен методом индуцированного мутагенеза с последующим введением рекомбинантной плазмиды pIEMЗ (Km^rTc^r) с клонированным геном В-субъединицы холерного токсина (ctxB). Штамм негемолитичен, не содержит основных генов вирулентности и авирулентен для лабораторных животных, обладает высоким и стабильным уровнем продукции В-субъединицы холерного токсина (продуцирует в среду выращивания 2,5-3 мкг/мл В-субъединицы ХТ) и протективных антигенов возбудителя холеры О139 серогруппы – О139 антигена и полисахаридной капсулы, обеспечивающих формирование антибактериального и антитоксического иммунитета при холере.

Изобретение относится к биотехнологии, а именно к конструированию штамма холерного вибриона О139 серогруппы, и может быть использовано в качестве основы для конструирования живых вакцин против диарейных заболеваний, вызываемых патогенными вибрионами V. cholerae О139, а также в качестве продуцента для выделения очищенной иммуногенной В-субъединицы холерного токсина, входящей в состав диагностической тест-системы, позволяющей выявлять токсигенные клоны V. cholerae О139.

В настоящее время отсутствуют эффективные живые вакцины против возбудителей холеры V. cholerae О139. В связи с этим возникает необходимость получения безопасных штаммов О139 серогруппы, продуцирующих протективные антигены, вызывающие образование антитоксического, антиколонизирующего и антибактериального иммунитета, и являющихся основой для дальнейшего конструирования вакцинных штаммов против холеры, вызываемой V. cholerae О139.

Известен вирулентный штамм SG25, на основе которого сконструирован авирулентный атоксигенный штамм V. cholerae L911 серогруппы О139, предложенный в качестве вакцинного штамма. Штамм V. cholerae L911 лишен гена, кодирующего А-субъединицу холерного токсина, и поэтому не образует основного фактора патогенности возбудителя холеры – холерного токсина. Однако, ввиду того, что штамм L911 сконструирован на основе штамма SG25, который содержит гены токсин-корегулируемых пилей, он является потенциально опасным. Токсин-корегулируемые пили адгезии служат рецепторами для фага СТХ

Задача изобретения – получение авирулентного, безопасного штамма с высокой продукцией протективных антигенов и являющегося основой для конструирования живых вакцин против диарейных заболеваний, вызываемых патогенными штаммами V. cholerae O139.

Сущность изобретения заключается в том, что полученный штамм удовлетворяет поставленным требованиям.

Заявляемый штамм создан на основе хорошо изученного природного авирулентного гемолизпозитивного (Hly⁺) штамма О139 серогруппы Vibrio cholerae 170, лишенного ключевых генов патогенности (ctxAB^– и tcpA^–), но продуцирующего О139-антиген и полисахаридную капсулу, являющихся протективными антигенами. На первом этапе методом индуцированного мутагенеза в геном штамма внесена мутация в ген hly, кодирующий биосинтез гемолизина, в результате которой штамм утратил способность образовывать этот фактор вирулентности. На втором этапе в Hly^– штамм методом конъюгации введена рекомбинантная плазмида рIЕМ3 (Кm^rТс^r) с клонированным геном В-субъединицы холерного токсина (ctxB). Данная плазмида несет в своем составе гены резистентности к двум антибиотикам – тетрациклину (tet) и канамицину (kan), а также ген ctxB, детерминирующий синтез иммуногенной В-субъединицы холерного токсина.

Изучение продукции В-субъединицы холерного токсина методом радиального пассивного иммунного гемолиза (РПИГ) и иммуноферментным методом (ELISA) у клеток штамма показало, что он образует значительные количества В-субъединицы холерного токсина и стабильно сохраняет этот признак при длительном хранении на питательных средах.

В результате получен авирулентный штамм V. cholerae O139, не продуцирующий гемолизин и стабильно образующий значительное количество иммуногенной В-субъединицы холерного токсина, а также протективных поверхностных антигенов – O139 антигена и полисахаридной капсулы.

Штамм депонирован в Государственной коллекции патогенных бактерий РосНИПЧИ “Микроб” (г.Саратов) под номером КМ168.

Культурально-морфологические, биохимические и серологические свойства штамма

Грамотрицательные, слегка изогнутые палочки, подвижные, с полярно расположенным жгутиком.

На твердых питательных средах формирует средней величины круглые, с ровными краями, мутные колонии сероватого цвета. При росте в бульоне вызывает равномерное помутнение среды.

Факультативный анаэроб. Ферментирует до кислоты без газа маннозу, сахарозу, маннит, мальтозу. Не ферментирует лактозу и арабинозу. По биохимической активности относится к I группе Хейберга. Не лизирует эритроциты барана. Прототроф.

Резистентен к диагностическим холерным фагам С и эльтор.

Агглютинируется диагностической О139-специфической холерной сывороткой (титр реакции агглютинации с монорецепторной О139 антисывороткой составляет 1:1600). Образует полисахаридную капсулу.

Не агглютинируется диагностическими холерными сыворотками О, Инаба, Огава, RO.

Основные свойства штамма

– Авирулентность.

– Отсутствие продукции гемолизина.

– Высокий уровень продукции O139 антигена и полисахаридной капсулы.

– Высокий уровень продукции В-субъединицы холерного токсина.

– Стабильность указанных свойств.

Пример 1. Определение наличия в геноме штамма КМ168 генов вирулентности.

Штамм КМ168 серогруппы O139 не содержит генов А-субъединицы холерного токсина – ctxA, основной субъединицы токсин-корегулируемых пилей адгезии – tcpA, одного из основных регуляторных генов toxT, непосредственно контролирующих экспрессию многих генов вирулентности, а также специфического участка внедрения фага СТХ в хромосому – attRS сайта. Детекцию вышеуказанных генов вирулентности проводят с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР) с праймерами на гены ctxA, tcpA, toxT и последовательности attRS. Для этого клетки штамма выращивают в течение 18 ч, лизируют кипячением и используют в концентрации 10⁷ кл/мл для исследования в ПЦР. Отсутствие специфического амплификата свидетельствует об отсутствии генов вирулентности у полученного штамма.

Пример 2. Определение продукции O139 антигена

Готовят ряд разведений сыворотки в изотоническом растворе хлорида натрия от 1:50 до ¹/₂ титра сыворотки в объеме 0,5 мл. Во все разведения сыворотки добавляют по 0,5 мл взвеси 18-24-часовой агаровой культуры, содержащей 1 млрд. микробных тел в 1 мл. После добавления культуры получают ряд разведений от 1:100 до 1:3200. Постановка реакции сопровождается двумя контролями – контролем антигена (0,5 мл взвеси культуры +0,5 мл изотонического раствора хлорида натрия) и контролем сыворотки (сыворотка в разведении 1:50). В качестве контрольного штамма используют V. cholerae P16064 cap^–, титр агглютинации которого составляет 1:1600.

Титр реакции агглютинации заявляемого штамма определяют как конечное разведение, в котором регистрируется образование мелкохлопчатого осадка. Титр агглютинации равен 1:1600.

Пример 3. Определение продукции капсулы по морфологии колоний

При выращивании на твердых питательных средах клетки, продуцирующие полисахаридную капсулу, образуют мутные колонии, в то время как у клеток, не образующих капсулу, колонии прозрачны. Штамм образует на плотных средах мутные колонии, что свидетельствует о его способности продуцировать полисахаридную капсулу.

Пример 4. Определение продукции гемолизина.

Для установления отсутствия продукции гемолизина культуру штамма предварительно рассевают до изолированных моноколоний на полноценных средах, после 18 ч роста клетки методом реплик наносят на полноценные агаровые среды с добавлением 1% бараньих эритроцитов и выращивают в течение 16-18 ч при температуре 37С. Заявленный штамм не образует зон лизиса эритроцитов вокруг макроколоний.

Пример 5. Определение продукции В-субъединицы холерного токсина

Для определения продукции В-субъединицы холерного токсина в сконструированном штамме используют реакцию пассивного иммунного гемолиза (РПИГ) на плотной среде и иммуноферментный метод (ELISA). При определении продукции В-субъединицы холерного токсина с помощью РПИГ изолированные клетки штамма наносят на плотную питательную среду, содержащую эритроциты барана. Зона просветления среды вокруг колоний штамма свидетельствует о продукции этим штаммом В-субъединицы холерного токсина. Размеры зоны иммунного гемолиза (3,5 мм) свидетельствуют о высокой продукции этого фактора иммуногенности у полученного штамма.

Также продукцию В-субъединицы холерного токсина определяют с помощью высокочувствительного количественного иммуноферментного метода ELISA. Установлено, что по результатам этого метода сконструированный штамм продуцирует в среду выращивания 2,5-3 мкг/мл В-субъединицы холерного токсина.

Пример 6. Определение стабильности

Стабильность наследования плазмиды рIЕМ3 определяют путем выращивания штамма в неселективных условиях без антибиотиков в течение 48-72 ч в жидкой питательной среде при 37С, затем рассевают до моноколоний на плотной питательной среде. Полученные изолированные колонии проверяют по маркерам резистентности плазмиды рIЕМ3, т.е. определяют способность клеток штамма расти на средах с канамицином (50 мкг/мл) и тетрациклином (2 мкг/мл). Клетки штамма в 100% случаях наследуют данную плазмиду.

Стабильность введенной рекомбинантной плазмиды проверяется также в условиях in vivo при выращивании штамма в организме биомоделей – в крольчатах-сосунках. Крольчат-сосунков заражают указанным штаммом внутрикишечно в дозе 110⁹ м.т. Через 48 ч после заражения содержимое кишечника высевают на плотную питательную среду, колонии проверяют на наличие плазмидных маркеров резистентости к антибиотикам. Установлено, что после 48-часового пребывания в кишечнике крольчат 82% изученных клонов сохраняют рекомбинантную плазмиду рIЕМ3.

Пример 7. Определение безвредности штамма

Безвредность сконструированного штамма изучают на модели крольчат-сосунков. Крольчат-сосунков заражают внутрикишечно в дозах 110⁹ и 510⁹ кл./мл. За животными наблюдают в течение 48 ч. Установлено, что введение полученного штамма не приводит к развитию диареи или гибели животных. У животных, зараженных штаммом, не наблюдается ни макроскопических, ни микроскопических изменений тканей.

Таким образом, заявляемый штамм негемолитичен, обладает высоким и стабильным уровнем продукции иммуногенной В-субъединицы холерного токсина и протективных антигенов O139 серогруппы – О139 антигена и полисахаридной капсулы, которые обеспечивают формирование антибактериального и антитоксического иммунитета. Штамм безопасен для лабораторных животных. Указанные свойства полученного штамма V. cholerae KM168 свидетельствуют о том, что он может использоваться как основа для конструирования живых вакцин против диарейных заболеваний, вызываемых патогенными штаммами V. cholerae О139, а также, являясь продуцентом В-субъединицы холерного токсина, может использоваться для выделения очищенной иммуногенной В-субъединицы холерного токсина, которая входит в состав диагностических тест-систем, позволяющих выявлять токсигенные клоны Vibrio cholerae О139.

Формула изобретения

Штамм бактерий Vibrio cholerae КМ 168 (Государственная коллекция патогенных бактерий “Микроб”) – основа для конструирования живых вакцин против диарейных заболеваний, вызываемых патогенными штаммами V. cholerae О139.

MM4A Досрочное прекращение действия патента Российской Федерации на изобретение из-за неуплаты в установленный срок пошлины за поддержание патента в силе

Дата прекращения действия патента: 28.10.2005

Извещение опубликовано: 10.12.2006 БИ: 34/2006

NF4A Восстановление действия патента СССР или патента Российской Федерации на изобретение

Дата, с которой действие патента восстановлено: 20.03.2008

Извещение опубликовано: 20.03.2008 БИ: 08/2008