Патент на изобретение №2236011

(54) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ АКТИВНОСТИ ФЕРМЕНТА СУКЦИНАТДЕГИДРОГЕНАЗЫ В КРОВИ

(57) Реферат:

Изобретение относится к области медицины, а именно к клинической биохимии, и может быть использовано для исследования функциональной деятельности эритроцитов, связанной с антирадикальной защитой. Сущностью изобретения является то, что в качестве продукта целевого назначения используют гемолизат крови, сукцинат натрия растворяют в фосфатном буферном растворе, добавляют в качестве акцептора водорода Nitro-BT (нитро-ВТ), который переходит в нитродиформазан, центрифугируют надосадочную жидкость и определяют активность сукцинатдегидрогеназы. Изобретение обеспечивает возможность определить активность фермента с большей достоверностью и малыми трудозатратами. 1 з.п. ф-лы.

Изобретение относится к области медицины, а именно к клинической биохимии, и может быть использовано для исследования функциональной деятельности эритроцитов, связанной с антирадикальной защитой, инициацией процессов оксигенации гемоглобина и приданием эритроцитам (Эр) протективных антибактериальных свойств в норме и при различных патологических процессах, протекающих в организме человека.

В крови (эритроцитах) определяют активность фермента супероксиддисмутазы (СОД) при помощи метода N.Nishkimi et al. (Biochem., biophys. Res. Commun. – 1972. – 46. – p.l46). Суть метода состоит в том, что в ней используют реакцию, основанную на способности СОД конкурировать с нитро синим тетразоль хлоридом (НСТ) за супероксидные анионы, образующиеся в результате аэробного взаимодействия восстановленного никотинамидаденин динуклеотида (НАДН) и фенозинметасульфата. При этой реакции НСТ восстанавливается с образованием окрашенного диформазана. СОД тормозит восстановление НСТ. По интенсивности окраски, измеряемой фотометрически на МКМФ-1 при =540 нм, определяют количество единиц СОД.

В качестве прототипа взят метод Кun Е. et Abood G. (Science, February. – 1949, 44. – p.1527), основанный на способности сукцинатдегидрогеназы (СДГ) в присутствии сукцината натрия восстанавливать бесцветную соль 2,3,5-трифенилтетразоля хлорида (2,3,5-Triphenil tetrazolium chloride, FW 334,81) в красное водорастворимое соединение – формазан. Интенсивность окраски измеряют после 30-минутной (при 35С) инкубации 1 мл 10% суспензии гомогенизированной печени в присутствии смеси: 1 мл 0,1% раствора 2,3,5-трифенилтетразоля, 0,5 мл 0,2 М раствора натриевой соли янтарной кислоты и 0,5 мл 0,1 М раствора фосфатного буфера с рН 7,4. Реакцию останавливают путем добавления 7 мл ацетона, после центрифугирования (1200 об/мин) супернатант колориметрируют на ФЭК-М с синим светофильтром в кювете с толщиной слоя 5 мм. По калибровочному графику определяют количество образовавшегося формазана в мкг. Активность СДГ выражают в единицах, для этого показатели экстинкций опытной пробы умножают на 100.

Недостатками метода являются: прекращение использования для аналитических целей трифенилтетразоль хлорида, длительность выполнения анализа, большие объемы реактивов и отсутствие четкой системы расчета.

Задачи настоящего изобретения – поиск нового способа определения активности сукцинатдегидрогеназы в крови (эритроцитах), сокращение трудозатрат, снижение стоимости определения активности СДГ, повышение достоверности.

Сущностью изобретения является то, что в качестве продукта целевого назначения используют гемолизат крови, сукцинат натрия растворяют в фосфатном буферном растворе, добавляют в качестве акцептора водорода Nitro-BT, который переходит в нитродиформазан, центрифугируют, надосадочную жидкость колориметрируют и определяют активности сукцинатдегидрогеназы по формуле:

А_СДГ=(Д_О-Д_К)2000 ед/мл,

где Д_О – конечная оптическая плотность смеси;

Д_К – начальная оптическая плотность смеси;

2000 – коэффициент пересчета, позволяющий определить активность фермента в 1 мл крови.

Способ позволяет определить также удельную активность сукцинатдегидрогеназы УА_СДГ (число единиц фермента на 1.10⁹ эритроцитов):

где Х – число эритроцитов в 1 мл крови.

Способ осуществляют следующим образом: в две центрифужные мерные пробирки параллельно вносят: 1) 0,5 мл фосфатсукцинатного реагента (в 25 мл 0,1 М Na-фосфатного буфера с рН 7,4 растворяют 810 мг сукцината натрия), 2) 0,5 мл гемолизата (1,9 дистиллированной Н₂О+100 мкл крови + 1 капля дигитонина) и ставят в водяной термостат при 35С. После 5-7-минутного прогревания в опытную пробирку вносят 0,5 мл 0,1% раствора Nitro Blue Tetrazolium chloride (FW 867,8; Nitro-BT) и тем самым запускают реакцию. Через 5 минут (строго по секундомеру) ее останавливают путем добавления 3,5 мл ацетона. В контрольную пробирку вначале вносят ацетон, а затем Nitro-BT. Пробирки оставляют на 3-5 минут в термостате, после чего центрифугируют в течение 12-15 минут, при 3000 об/мин и колориметрируют на КФК-2МП при =460 нм в кювете с толщиной слоя 5 мм.

Для расчета активности СДГ был построен калибровочный график по стандартным растворам диформазана (окрашенного в красно-фиолетовый цвет), в который превращается Nitro-BT. За единицу СДГ принимают количество фермента, восстанавливающего 1 мкг Nitro-BT в диформазан за 1 минуту при 35С.

Активность СДГ рассчитывают по формуле:

А_СДГ=(Д_О-Д_К)2000 ед/мл,

где Д_О – оптическая плотность опытной пробы;

Д_К – оптическая плотность контрольной пробы;

2000 – коэффициент пересчета, найденный по калибровочной кривой.

Пример 1. Определение активности сукцинатдегидрогеназы в крови у здоровой женщины репродуктивного возраста. Из локтевой вены пациентки В взяли 5 мл крови и перенесли в пробирку, куда предварительно было внесено 2 капли гепарина. В ней определили количество эритроцитов (оно=4,3410⁹ Эр/мл). 1) Приготовили гемолизат крови (к 1,9 мл дистиллированной Н₂О добавили 100 мкл крови). 2) В две центрифужные мерные пробирки внесли по 0,5 мл фосфатсукцинатного реагента и в каждую добавили по 0,5 мл гемолизата. 3) Пробирки поместили в водяной термостат (35С) и прогрели 7 мин, после чего в опытную пробирку добавили 0,5 мл 0,1% раствора Nitro-BT и включили секундомер, через 5 мин реакцию остановили добавлением 3,5 мл ацетона. 4) В контрольную пробирку внесли 3,5 мл ацетона, содержимое тщательно перемешали, добавили 0,5 мл 0,1% Nitro-BT и вновь перемешали. После 3 мин инкубации содержимое обеих пробирок подвергли 12-минутному центрифугированию при 3000 об/мин. 5) Надосадочную жидкость обеих пробирок осторожно перенесли в две кюветы с толщиной слоя 5 мм и произвели колориметрию на КФК-2МП при =560 нм. Измерениями установлено: Д_О=0,374, Д_К=0,184;

А_СДГ=(0,374-0,184)2000=380 ед/мл;

УА_СДГ=380:4,37=87,5 ед/1.10⁹ Эр

Пример 2. Определение активности СДГ у женщины с беременностью, осложненной гестозом. У роженицы Р в предродовом периоде взяли из локтевой вены 5 мл крови и добавили 2 капли гепарина. Определили количество эритроцитов (оно=3,510⁹/ мл). Приготовили гемолизат (1,9 мл дистиллированной Н₂О+100 мкл крови), а затем в 2-х пробирках – реакционную смесь (0,5 мл сукцинатфосфатного реагента + 0,5 мл гомолизата). После 5-минутного прогревания пробирок в водяном термостате (35С) в опытную пробирку внесли 0,5 мл раствора Nitro-BT и включили секундомер. Ровно через 5 минут реакцию остановили добавлением 3,5 мл ацетона. В контрольную пробирку вначале внесли ацетон, а затем Nitro-BT. Пробирки оставлены на 5 мин в термостате, а затем их содержимое подвергнуто 10-минутному центрифугированию. Надосадочную жидкость осторожно перенесли из пробирок в кюветы и произвели измерения оптической плотности. Этими измерениями установлено: Д_О=0,429, Д_К=0,171.

А_СДГ=(0,429-0,171)2000=515 ед/мл;

УА_СДГ=515:3,5=147 ед/10⁹ Эр.

Этими исследованиями показано, что активность фермента сукцинатдегидрогеназы эритроцитов небеременной женщины и у женщины с беременностью, осложненной гестозом в предродовом периоде, имеет существенные отличия. Отличия СДГ наблюдаются как на уровне объема крови, так и на уровне удельной активности фермента (в 1 млрд. Эр). При беременности, осложненной гестозом, она выше.

Использование способа определения активности сукцинатдегидрогеназы даст возможность оценить функциональное состояние эритроцитов как одного из показателей, участвующих в инициации процессов оксигенации гемоглобина, выявить анемическую или гипоксическую гипоксию. Это найдет место в таких областях медицины, как акушерство, хирургия, гематология, реаниматология, анестезиология, терапия, педиатрия и др. Его также можно будет использовать при отборе лиц, задействованных в профессиях, которые связаны с угрозой гипоксии.

Поставленные задачи решены путем найденного нового способа определения активности сукцинатдегидрогеназы в крови (эритроцитах), сокращением трудозатрат, снижением стоимости определения активности фермента и повышением достоверности анализа.

Формула изобретения

1. Способ определения активности сукцинатдегидрогеназы в крови путем центрифугирования, колориметрирования надосадочной жидкости в присутствии ацетона, отличающийся тем, что берут гемолизат крови, дополнительно добавляют сукцинат натрия в растворе фосфатного буфера, затем нитро-ВТ, после чего добавление ацетона проводят через 5 мин, и в надосадочной жидкости определяют активность сукцинатдегидрогеназы (А_СДГ) и рассчитывают ее по формуле, ед./мл:

А_СДГ=(Д_О-Д_К)2000,

где Д_О – оптическая плотность опытной пробы;

Д_К – оптическая плотность контрольной пробы;

2000 – коэффициент пересчета.

2. Способ по п.1, отличающийся тем, что может быть рассчитана удельная активность (уА_СДГ) в единицах на 110⁹ эритроцитов:

где Х – число эритроцитов (млрд) на 1 мл крови.

MM4A Досрочное прекращение действия патента Российской Федерации на изобретение из-за неуплаты в установленный срок пошлины за поддержание патента в силе

Дата прекращения действия патента: 08.10.2004

Извещение опубликовано: 10.12.2006 БИ: 34/2006