Патент на изобретение №2235780
|
||||||||||||||||||||||||||
(54) ГИДРОКСИЛИРОВАНИЕ КОМПАКТИНА ДО ПРАВАСТАТИНА С ПОМОЩЬЮ MICROMONOSPORA
(57) Реферат:
Изобретение относится к области биотехнологии и касается нового микробного способа получения соединения формулы (I) из соединения общей формулы (II), (формулы I и II приведены в формуле изобретения), в которой R означает щелочной металл или ион аммония, с помощью погруженной культуры штамма, который способен 6 Данное изобретение относится к новому микробному способу получения правастатина. Точнее, данное изобретение относится к микробному способу получения правастатина формулы (I) из соединения формулы (II) в которой R означает щелочной металл или ион аммония, посредством микроорганизма, где названный микроорганизм представляет собой прокариот из рода Micromonospora, который способен гидроксилировать соединение общей формулы (II) по 6 Гиперхолестеринемию рассматривают как основной фактор риска в отношении атеросклеротического заболевания, особенно ишемического заболевания сердца. В течение последних двух десятилетий интенсивно изучали 3-гидрокси-3-метилглутарил-коэнзим А-редуктазу (HMG-CoA-редуктаза КФ 1.1.1.34), главный фермент, лимитирующий скорость в биосинтезе холестерина. Как было обнаружено, мевинолин и родственные соединения, биологически синтезированные определенными штаммами различных грибковых видов, являются конкурентными ингибиторами упомянутого фермента [Endo A. et al., J. Antibiotics 29, 1346-1348 (1976); Endo A. et al., FEBS Lett. 72, 323-326 (1976); Kuo, C.H. et al., Org. Chem. 48, 1991-1998 (1983)]. Правастатин также является представителем семейства ингибиторов HMG-CoA-редуктазы. Сначала, в ходе исследований метаболизма компактина [Arai M. et al., Sankyo Kenkyusho Nempo, 40 1-38 (1988)], правастатин был обнаружен как минорный мочевой метаболит компактина у собаки [Tanaka M. et al., неопубликовано]. Главной характерной особенностью правастатина как гидроксилированного продукта компактина является его тканевая избирательность. Названное лекарственное средство сильно ингибирует синтез стеролов в печени и кишечнике, но слабо – в других органах. Преимущество заключается в том, что правастатин проявляет более низкую токсичность, чем другие ингибиторы HMG-CoA-редуктазы. Описано, что микробное гидроксилирование компактина может осуществляться в разной степени некоторыми штаммами видов, принадлежащих к различным родам грибов и штаммами видов актиномицет, принадлежащих к родам Nocardia, Actinomadura и Streptomyces, среди прочих Streptomyces roseochromogenes и Streptomyces carbophilus (патент США №5179013, патент США №4448979, патент США 4346227, патент США №4537859, патент Японии №58010572). Проблема использования грибов для получения правастатина из компактина заключается в том, что упомянутые микроорганизмы в основном не допускают более высоких концентраций компактина в жидкой культуральной среде, по-видимому, вследствие их противомикробной активности [Serizawa N. et al., J. Antibiotics 36, 887-891(1983)]. Показано, что у Streptomyces carbophilus система цитохрома Р450 является необходимой для гидроксилирования компактина до правастатина [Matsuoka, Т. Et al., Eur. J. Biochem. 184, 707-713 (1989)]. Трудность генетического улучшения способности гидроксилирования с использованием такого фермента заключается в том, что он представляет собой комплекс белков, а не один белок. Исследования заявителей были сфокусированы на обнаружении штамма актиномицет, который бы продуцировал правастатин из солей кислой формы компактина с более высоким выходом и в результате применения более высоких концентраций субстрата при биоконверсии, чем концентрации, известные из предшествующих патентных заявок. Во время скрининга, охватывающего приблизительно 6000 актиномицет, большей частью собственные штаммы, а также аутентичные штаммы из международной коллекции штаммов, пять Streptomyces и пять Micromonospora были выбраны для дальнейших исследований, так как они оказались способными гидроксилировать натриевую соль кислой формы компактина в правастатин. Выбранные десять штаммов актиномицет, из которых восемь оказались таксокомически идентичными на видовом уровне, представляют собой следующие: Streptomyces violaceus (согласно Kampfer et al., 1991), штамм №1/43. Streptomyces rochei (Berger et al., 1949; Waksman and Lechevalier, 1953), штамм №1/41. Streptomyces resistomyificus (Lindenbein, 1952), штамм №1/44. Streptomyces sp., штамм №1/28. Streptomyces lanatus, (Frommer, 1959), штамм №1/16. Micromonospora sp., штамм №IDR-Р3. Micromonospora purpurea (Luedemann and Brodsky, 1964), штамм №IDR-P4. Micromonospora echinospora (Luedemann and Brodsky/ 1964), штамм №IDR-P5. Micromonospora megalomicea (Weinstein et al., 1969), штамм №IDR-P6. Micromonospora rosaria (Horan and Brodsky, 1986), штамм №IDR-P7. Так как вплоть до настоящего времени в литературе нет данных относительно способности Micromonospora превращать соли кислой формы компактина в правастатин, основательно изучали не только эту специфическую энзиматическую способность, а также таксономическое положение вышеперечисленных штаммов Micromonospora. Таксономическое положение штаммов IDR-P3, -Р4, -P5, -Р6 и –P7 на родовом уровне Все названные штаммы продуцировали хорошо развитый мицелий, составленный из разветвленных гиф приблизительно 0,4-0,7 мкм в диаметре. Воздушный мицелий отсутствует или имеется только в небольших количествах. Неподвижные споры располагаются на спорофорах поодиночке. Гифы субстратного мицелия являются грамположительными и неустойчивыми в кислой среде. Штаммы №№IDR Р3-Р7 являются аэробными, хемоорганотрофическими и чувствительными к рН ниже 6,0. Стенки содержат мезодиамино-пимелиновую кислоту. Перечисленные выше отличительные свойства – как ключевые признаки – четко демонстрируют, что названные штаммы моноспоровых актиномицет являются типичными представителями рода Micromonospora. Таксономическое описание Micromonospora sp., штамм №IDR-Р3 Микроморфологические свойства: субстратный мицелий составлен из хорошо развитых, скорее извитых, чем прямых, моноподиально разветвленных филаментов. Споры на спорофорах оказываются одиночными, сферическими, приблизительно 1,8 мкм в диаметре, и более или менее равномерно диспергированными на гифовых филаментах. Споры или прикреплены, или находятся на концах коротких спорофор. В бульонных культурах споры не были обнаружены на гифах вероятно потому, что высвобождение зрелых спор происходит очень быстро. Культуральные макроморфологические свойства: агар Чапека с сахарозой: рост в среде, колонии имели красноватый цвет, покрыты подобными точкам, черными спекулирующими областями. Глюкозный агар с аспарагином: рост регистрировали как подобные точкам и приподнятые, красновато-коричневые или черные колонии. Красноватые диффузные пигменты. Питательный агар: прекрасный рост, приподнятые, красновато-коричневые или черные колонии. Красновато-коричневый экзопигмент в среде. Агар с дрожжевым экстрактом и экстрактом солода (ISP Мед.2): хорошо растущие, приподнятые и морщинистые, коричневые колонии, частично покрытые черными спорулирующими областями или “псевдо-воздушным мицелием” (это проявляется как ограниченный белесоватый или сероватый налет). Коричневатый или коричневато-красный растворимый пигмент. Крахмальный агар с неорганическими солями (ISP Мед. 4): рост в среде красновато-коричневых, приподнятых и морщинистых колоний. Ярко-красноватый растворимый пигмент. Агар с глицерином и аспарагином (ISP Мед. 5): рост только в небольших количествах не совсем белых или ярко-оранжевых, плоских колоний, ярко-розовый растворимый пигмент. Утилизация источников углерода: наблюдали хороший рост и позитивную утилизацию L-арабинозы, D-галактозы, D-фруктозы, D-глюкозы, D-ксилозы, лактозы, мелибиозы, сахарозы, D-маннита, дульцита, глицерина и инозита. Рост в присутствии L-рамнозы, D-рафинозы и инулина был несколько лучше, чем на негативной контрольной среде. Утилизация источников азота: хороший рост отмечен в присутствии экстракта дрожжей и NZ-амина, наблюдали слабую утилизацию NаNО3 или отсутствие утилизации NаNО3. Другие физиологические и биохимические характеристики: целлюлоза и крахмал гидролизовались, молоко эффективно усваивалось. Тест нитратного восстановления был отрицательным. Не наблюдали никакого роста на срезах картофеля в отсутствие карбоната кальция (рН 5,8-6,0). Не было никакой продукции меланоидного пигмента. Описанный штамм №IDR-Р3 Micromonospora sp. был выделен из образца ила из озера Балатон (Венгрия). Положение в систематике: дальнейшие систематические исследования оказались необходимыми для выяснения точного таксономического положения описанного штамма среди видов из рода Micromonospora. На основании определенных свойств можно, по-видимому, предположить, что штамм IDR-Р3 представляет собой новый вид в роду Micromonospora. Дифференциально-диагностическое описание и идентификация штаммов Micromonospora IDR-P4, -P5, -Р6 и -P7 Штамм IDR-P4 Обычно на вышеперечисленных диагностических средах наблюдали хороший рост окрашенных в оранжевый до оранжево-красного, красный, иногда желтоватый или розовый цвет колоний. Растворимые пигменты и воздушный мицелий не продуцируются. Количество одиночных спор является относительно низким. Споры встречаются на спорофорах ограниченно. Субстратный мицелий состоит из хорошо разветвенных гиф. Воздушный мицелий отсутствует. Нет никакого роста на D-мелибиозе, рафинозе, манните, глицерине, лактозе, L-рамнозе, но имеет место хороший рост на D-арабинозе, глюкозе, D-ксилозе, и слабый рост – на D-галактозе и D-фруктозе. На основании перечисленных диагностических свойств идентифицировали описанный штамм как представителя вида (Micromonospora purpurea (Luedemann and Brodsky, 1964). Штамм IDR-P5 Данный штамм продуцирует большей частью одиночные спорофоры и сферические темно-коричневые до черных споры (0,8-1,5 мкм в диаметре), которые остаются прочно прикрепленными к спорофорам до созревания. Согласно электромикроскопическим исследованиям, на поверхности названных спор можно наблюдать бородавчатые структуры или выросты (“тупые шипы” согласно Vol. 4 Bergey’s Manual of Syst. Bact. 1989, pages 2448), которые являются очень характерными спорами Micromonospora echinosora. Иначе говоря, культурально-морфологические и физиологические диагностические свойства штамма также очень похожи на свойства М. echinospora. Цвет хорошо развитых колоний на стандартной диагностической среде является оранжево-коричневым или темно-пурпурным. Спорулирующий слой оказывается черным или багрово-черным, восковым. Воздушный мицелий отсутствует. Меланиновый пигмент не продуцируется. Молоко усваивается. Хороший рост отмечен на D-ксилозе, D-арабинозе, D-глюкозе и сахарозе, но нет роста на L-рамнозе, рафинозе, D-галактозе, D-фруктозе, D-мелибиозе и глицерине. Данный штамм считают типичным представителем Micromonospora echinospora. Штамм IDR-Р6 На большинстве из диагностических сред отмечен умеренный до слабого рост. Оранжевые или оранжево-красные колонии состоят из длинных разветвленных филаментов (приблизительно 0,6 мкм в диаметре) и ограниченного количества одиночных сферических, темного цвета спор (0,6-1,0 мкм в диаметре). Не продуцируется воздушный мицелий. В определенных средах образуются слабоокрашенные, красноватые или розовые, растворимые пигменты. На агаре с тирозином не продуцируются меланоидные пигменты. На основной среде описанный штамм утилизировал следующие источники углерода: D-ксилозу и D-фруктозу; только слабо: D-мелибиозу, маннит и галактозу, но никакого роста спор не наблюдали в присутствии глицерина, L-рамнозы, лактозы и рафинозы (см. также Kawamoto I. et al.: Agric. Biol. Chem., 47, 203-215, 1983). Штамм IDR-Р6 продемонстрировал значительное сходство с видом Micromonospora megalomicea (Weinstein, 1972) и данный штамм считают представителем упомянутого вида. Штамм IDR-P7 Хороший рост на агаре Беннетта (Bennett), агаре Чапека с сахарозой, глюкозном агаре с аспарагином, питательном агаре, агаре из овсяной муки, картофельном агаре с декстрозой и так далее. Окраска растительных пигментов колеблется от красновато-коричневого до пурпурно-коричневого. На определенных средах образуются темно-красные диффузные пигменты. На поверхности колоний часто продуцируются черные споры. Растительные гифы (средний диаметр 0,5 мкм) интенсивно разветвляются. Споры (1,4-1,7 мкм в диаметре), прикрепленные или на коротких спорофорах, располагаются поодиночке, и встречаются по длине гиф. Рост и споруляция происходят по типу открытого сплетения по Luedemann. Данный штамм утилизировал следующие соединения только как источник углерода в среде: D-глюкозу, лактозу, D-маннит, L-рамнозу, сахарозу и D-ксилозу. Дульцит, глицерин, D-мелибиоза и D-рафиноза не утилизировались. Штамм №IDR-P7 идентифицирован как типичный представитель Micromonospora rosaria (Horan and Brodsky, 1986). Представленные выше штаммы Micromonospora были депонированы в Национальной коллекции сельскохозяйственных и промышленных микроорганизмов (National Collection of Agricultural and Industrial Microorganisms; NCAIM), Будапешт, Венгрия, под нижеприведенным номерами – указателями: Micromonospora sp. IDR-Р3 NCAIM (P) В 001268 Micromonospora purpurea IDR-P4 NCAIM (P) В 001271 Micromonospora echinospora ssp. echinospora IDR-P5 NCAIM (P) В 001272 Micromonospora megalomicea ssp. nigra IDR-P6 NCAIM (P) В 001273 Micromonospora rosaria IDR-P7 NCAIM (P) В 001274 На основании вышеизложенного изобретение относится к новому микробному способу получения правастатина формулы (I) из соединения общей формулы (II) в которой R означает щелочной металл или ион аммония, в результате культивирования штамма под слоем жидкости, который способен 6 a) культивирования штамма вида, относящегося к роду Micromonospora, который способен 6 b) подачи субстрата, который трансформируется в растущей культуре, затем c) гидроксилирования субстрата до окончания биоконверсии, потом d) выделения соединения формулы (I) из бульона культуры и, если необходимо, очистки соединения. Сфера действия изобретения распространяется на дикие штаммы и любые мутанты вида, относящегося к роду Micromonospora, которые способны гидроксилировать натриевые соли кислой формы компактина до правастатина. В соответствии с предпочтительным аспектом данного изобретения, правастатин продуцируется штаммом Micromonospora, выбранным из группы, состоящей из Micromonospora sp. IDR-Р3 [NCAIM (Р) В 001268], Micromonospora purpurea IDR-P4 [NCAIM (P) В 001271], Micromonospora echinospora IDR-P5 [NCAIM (Р) В 001272], Micromonospora megalomicea IDR-P6 [NCAIM (Р) В 001273] и Micromonospora rosaria IDR-P7 [NCAIM (Р) В 001274]. Согласно наиболее предпочтительному аспекту изобретения правастатин продуцируется штаммом IDR-Р3 Micromonospora sp. [NCAIM (P) В 001268]. Данное изобретение может быть выполнено in situ с помощью способа ферментации, то есть когда гидроксилирование достигается при участии активно растущей культуры Micromonospora. Гидроксилирование можно проводить, применяя перемешивание культуры в качалочной колбе или аэрирования и перемешивания в ферментерах, после того как соединение формулы (I) добавляли в растущие культуры. В таких случаях можно использовать пеногаситель. Адекватная плотность культуры названного штамма может быть достигнута в результате применения соответствующей среды, содержащей подходящие источники углерода и азота, неорганических солей, а также микроэлементов. Оказывается, что, например, глюкоза, глицерин, декстрин, крахмал, рамноза, ксилоза, сахароза и растворимый крахмал являются ассимилируемыми источниками углерода, в то время как соевая мука, кукурузный экстракт, пептон, экстракт дрожжей, мясной экстракт, цитрат аммония и сульфат аммония являются хорошими источниками азота. Такие неорганические соли как карбонат кальция, фосфаты натрия, фосфаты калия и так далее, могут быть добавлены в культуральную среду. Предпочтительными средами для роста данного выбранного штамма являются среды, описанные в примерах. Биоконверсию компактина до правастатина можно осуществить с помощью различных способов ферментации, например, в периодической культуре или подпитываемой культуре. Предпочтительно использовали перемешиваемую погруженную культуру. Предпочтительная температура составляет приблизительно 25 Предпочтительный рН соответствует приблизительно 6,0-9,0, наиболее предпочтительно – приблизительно 7,0-8,5. Предпочтительные условия перемешивания соответствуют приблизительно 200 оборотам в минуту до 400 оборотов в минуту, наиболее предпочтительно приблизительно 250 оборотов в минуту. Изобретение предусматривает способ превращения натриевой соли кислой формы компактина до правастатина. Натриевую соль кислой формы компактина можно использовать в данном изобретении при любой концентрации, которая приведет к продукции правастатина. Предпочтительно концентрация компактина находится между 0,1 и 10 г/литр, более предпочтительно составляет приблизительно между 0,3 и 3,0 г/литр. В изобретении предусматривается рассмотрение любого процента превращения компактина до правастатина посредством штаммов Micromonospora spp., по меньшей мере, 30% и наиболее предпочтительно, по меньшей мере, приблизительно 90%. Во время ферментации состав культуральной среды контролировали с помощью способа высокоэффективной жидкостной хроматографии (HPLC; ВЭЖХ). В соответствии со способом ВЭЖХ, образец среды разбавляли вдвое метанолом, центрифугировали, и супернатант использовали для анализа. Параметры системы ВЭЖХ, использованные для анализа, составляли: аналитическое оборудование ВЭЖХ Waters; колоночная упаковка: Waters Novapack C18 5 мкм; измерение при 237 нм; введение объема 10 мкл; скорость течения 0,6-0,9 мл/мин, линейный градиент; использовали градиентную элюцию: растворитель А = ацетонитрил – 0,1 М NаН2РO4 в воде (25:75), растворитель В + ацетонитрил – вода (рН 2 посредством Н3РO4) (70:30). Время удерживания: правастатина (соль Na) 10,6 мин; компактина (Na-соль кислоты) 19,5 мин; правастатина (лактонная форма) 17,3 мин, компактина (лактонная форма) 23,5 мин. Для выделения правастатина может быть использован любой известный способ выделения, например, экстракция – реэкстракция, анионообменная хроматография, осаждение. Для извлечения продукта из бульона полезно принимать во внимание тот факт, что во время биоконверсии правастатин образуется в его кислой форме, таким образом, он может быть выделен из фильтрата среды в результате его абсорбции на колонке с анионообменной смолой. Для выделения продукта полезно применение сильной основной анионообменной смолы, которая представляет собой полимер полистилол-дивинилбензола, несущий активные группы четвертичного аммония, например, смолы Dowex А1 400 (ОН–), Dowex 1 После завершения биоконверсии правастатин можно экстрагировать из ферментационного бульона или из фильтрата, полученного после выделения из массы мицелия. Последний может быть удален или фильтрацией, или центрифугированием, однако – особенно в промышленном масштабе – целесообразно производить экстракцию цельного бульона. До экстракции рН или ферментационного бульона или фильтрата бульона приводили к 3,5-3,7 минеральной кислотой, предпочтительно разбавленной серной кислотой. Экстракцию производили сложным эфиром уксусной кислоты, содержащим алифатический спирт из 2-4 атомов углерода, предпочтительно этилацетат или изобутилацетат. Этилацетатный экстракт промывали водой и высушивали безводным сульфатом натрия. Затем из правастатина получали лактонное производное. Замыкание лактонного кольца проводили в растворе высушенного этилацетата при комнатной температуре при непрерывном перемешивании, индуцируя образование лактона каталитическим количеством трифторуксусной кислоты. Замыкание лактонного кольца проверяли с помощью анализа методом тонкослойной хроматографии (TLC; ТСХ). После завершения образования лактона раствор этилацетата промывали сначала 5% водным раствором бикарбоната натрия, а затем водой, и раствор лактона высушивали безводным сульфатом натрия и упаривали в вакууме. Остаток очищали способом колоночной хроматографии на силикагеле, используя в качестве элюирующих смесей этилацетат – н-гексан при постепенном увеличении содержания этилацетата. Правастатин получали из лактона правастатина в результате гидролиза при комнатной температуре в ацетоне с эквивалентным количеством гидроокиси натрия. Когда образование натриевой соли правастатина было закончено, правастатин осаждали ацетоном. Затем осадок отфильтровывали и промывали ацетоном и н-гексаном и высушивали в вакууме, потом кристаллизовали из смеси этанол – этилацетат. Установлено, что хроматография через гель сефадекса LH-20 благоприятно подходит для очистки правастатина. В результате применения упомянутого способа может быть получен правастатин, превышающий чистоту 99,5% (измерена с помощью ВЭЖХ). В ходе экспериментов сделано следующее открытие: из экстракта органического растворителя, предпочтительно из этилацетатного или изобутилацетатного экстракта бульона или бульонного фильтрата штамма IDR-Р3 Microiaonospora, который способен 6 Правастатиновые соли органических вторичных аминов можно трансформировать в правастатин гидроокисью натрия или алкоксидом натрия, предпочтительно этоксидом натрия. Выделение правастатина через интермедиат в виде соли вторичного амина является более простым способом, чем любой из когда-либо известных способов выделения. В процессе выделения не возникали артефакты, и таким образом отделение правастатина от побочных продуктов биоконверсии и от различных метаболических продуктов, биосинтезированных гидроксилирующим микроорганизмом, может быть благоприятно решено. Способ согласно изобретению представлен следующими примерами. Пример 1 Споры получали с поверхности 7-10 дневной культуры штамма Micromonospora sp. IDR-Р3 [NCAIM (P) В 001268, выращенной на скошенном растворимом крахмальном агаре (SM), и суспендировали в 5 мл стерильной дистиллированной воды. Затем полученную суспензию использовали для засевания 100 мл стерильной посевной среды TI в 500-мл колбе Эрленмейера (Erlenmeyer). Состав среды SM Растворимый крахмал 10,0 г Na2HPO4 1,15 г KH2PO4 0,25 г КСl 0,2 г MgSO4 Агар 15,0 г в 1000 мл дистиллированной воды рН среды доводили до 7,0 до стерилизации и смесь стерилизовали при 121 Состав среды TI Растворимый крахмал 20,0 г Экстракт дрожжей 10,0 г в 1000 мл водопроводной воды рН доводили до 7,0 перед стерилизацией и производили термообработку при 121 Растущую культуру встряхивали на роторном шейкере (250 оборотов в мин и амплитуда 2,5 см) в течение 3 дней при 32 Состав среды ТТ Картофельный крахмал 30,0 г Соевая мука 30,0 г СаСО3 5,0 г CoCl2 x 6H2O 2,0 мг Пальмовое масло 2,0 г в 1000 мл водопроводной воды рН доводили до 7,0 перед термостерилизацией. Инкубацию проводили при 32 После окончания ферментации культуры объединяли, а из полученного совокупного ферментационного бульона, который содержал 410 мг правастатина, выделение последнего проводили следующим образом: ферментационный бульон центрифугировали при 2500 оборотах в мин в течение 20 мин. Супернатант бульона и массу мицелия разделяли, затем последний повторно суспендировали в 250 мл воды и полученную суспензию перемешивали в течение одного часа и фильтровали. рН объединенного отцентрифугированного бульона и фильтрата приводили к 4,0 15% серной кислотой, потом кислый фильтрат экстрагировали этилацетатом 3 Осадок фильтровали, промывали 2 мл ацетона, а затем 2 мл н-гексана и высушивали в вакууме при комнатной температуре. Полученный неочищенный правастатин растворяли в этаноле, осветляли углем, затем кристаллизовали из смеси этанол-этилацетат. Таким образом получено 170 мг правастатина. Точка плавления 170-173 [ Спектр поглощения в ультрафиолете (20 мкг/мл, в метаноле): Спектр поглощения в инфракрасной области (КВr): 1H-ЯМР спектр (D2O, 13С-ЯМР спектр (D2O, Положительный масс-спектр FAB (характерные ионы): [M+Na]+469; [M+H]+447. Отрицательный масс-спектр FAB (характерные ионы): [М-Н]–445, [M-Na]–423, m/z 101 {2-метилмасляная кислота-Н]–. Пример 2 10 колб Эрленмейера объемом 500 мл, каждая из которых содержала 100 мл биоконверсионной среды МТ1, засевали культурой, полученной, как описано в примере 1, затем инкубировали при 28 Картофельный крахмал 10,0 г Декстроза 20,0 г Соевая мука 10,0 г Экстракт дрожжей 10,0 г СаСО3 5,0 г Подсолнечное масло 2,0 г в 1000 мл водопроводной воды рН биоконверсионной среды доводили до 7,0 перед стерилизацией. Смесь стерилизовали при 121 После окончания периода биоконверсии культуры объединяли, и правастатин выделяли из совокупного бульона в соответствии со следующим способом: объединенный бульон, который содержал 750 мг правастатина согласно анализу ВЭЖХ, центрифугировали при 2500 оборотах в мин в течение 20 мин. Выделенную массу мицелия перемешивали с 250 мл воды в течение часа, затем фильтровали. Отцентрифугированный бульон и фильтрат объединяли, и рН полученного раствора приводили к 3,5-4,0 15% серной кислотой, потом раствор экстрагировали этилацетатом 3 Пример 3 В лабораторном ферментере 4,5 литра среды ТТ/2 стерилизовали при 121 Состав биоконверсионной среды ТТ/2 Глюкоза 75,0 г Растворимый крахмал 50,0 г Соевая мука 50,0 г Экстракт дрожжей 50,0 г Пептон 5,0 г NаNО3 20,0 г СаСО3 25,0 г в 4500 мл водопроводной воды Пример 4 В лабораторном ферментере стерилизовали 4,5 литра ферментационной среды ТТ/1 при 121 Состав биоконверсионной среды ТТ/1 Глюкоза 125,0 г Картофельный крахмал 25,0 г Соевая мука 50,0 г Экстракт дрожжей(GISТЕХ) 50,0 г Пептон 50,0 г CoCl2 Подсолнечное масло 10,0 г в 4500 мл водопроводной воды рН биоконверсионной среды приводили к 7,0 перед стерилизацией. Культивирование продолжали при 28 После окончания биоконверсии правастатин, полученный в концентрации 1800 мкг/мл, выделяли следующим образом: 5 литров культурального бульона центрифугировали при 2500 оборотах в мин в течение 20 мин. Затем к отделенной массе мицелия добавляли 2 литра воды, и суспензию перемешивали в течение одного часа и фильтровали. Полученные два фильтрата объединяли и пропускали со скоростью 500 мл/час через колонку, заполненную 300 г (540 мл) смолы Dowex AI 400 (ОН–) (диаметр колонки 4 см, высота слоя смолы 43 см), затем слой смолы промывали 1 литром деионизированной воды. После этого колонку элюировали 1 литром смеси ацетон-вода (1:1), содержащей 10 г хлорида натрия, собирая фракции по 50 мл. Фракции анализировали с помощью ТСХ, как описано в примере 1. Фракции, содержащие продукт, объединяли, и ацетон отгоняли в вакууме. pН концентрата приводили к значению 3,5-4,0 15% серной кислотой, затем концентрат экстрагировали этилацетатом 3 Пример 5 Суспензию спор получали с использованием 5 мл стерильной дистиллированной воды с поверхности 10-дневной культуры, выращенной на растворимом крахмальном скошенном агаре, как описано в примере 1, штамма Micromonospora echinospora ssp. echinospora IDR-P5 [NCAIM (P) 001272], способного 6( В конце биоконверсии содержание правастатина ферментационного бульона определяли с помощью способа ВЭЖХ. В это время средняя концентрация правастатина составляла 40 мкг/мл. Пример 6 Ферментацию, подачу субстрата и биоконверсию проводили со штаммом IDR-P6, [NCAIM (Р) В 001273] Micromonospora megalomicea ssp. nigra, как описано в примере 5. Содержание правастатина ферментационного бульона определяли с помощью способа ВЭЖХ. В конце биоконверсии содержание правастатина бульона составляло 50 мкг/мл. Пример 7 5 мл посевной культуры штамма IDR-P4 [NCAIM (Р) В 001271] Micromonospora purpurea, полученного, как описано в примере 1, использовали для засевания 100-100 мл среды ТТ/14, распределенной по 500-мл колбам Эрленмейера, и стерилизовали в течение 25 мин при 121 Состав среды ТТ/14 Картофельный крахмал 5,0 г Глюкоза 25,0 г Экстракт дрожжей (GISTEX) 15,0 г Пептон 15,0 г СаСО3 1,0 г в 1000 мл водопроводной воды рН биоконверсионной среды доводили до 7,0 перед стерилизацией. Колбы встряхивали на роторном шейкере (250 оборотов в мин, амплитуда 2,5 см) в течение 3 дней. Подачу субстрата, биоконверсию и определение содержания правастатина проводили, как описано в примере 5. В конце биоконверсии содержание правастатина в ферментационном бульоне составляло 40 мкг/мл. Пример 8 Ферментацию, подачу субстрата и биоконверсию проводили со штаммом IDR-P7, [NCAIM (Р) В 001274] Micromonospora rosaria, как описано в примере 1. В конце биоконверсии было определено 350 мкг/мл правастатина в ферментационном бульоне с помощью способа ВЭЖХ. Формула изобретения
1. Микробиологический способ получения соединения формулы (I) из соединения общей формулы (II) в которой R означает щелочной металл или ион аммония, включающий в себя стадии а) культивирования штамма Micromonospora, который способен 6 2. Способ по п.1, в котором применяют штамм IDR-P3 Micromonospora sp., депонированный в Национальной коллекции сельскохозяйственных и промышленных микроорганизмов, Будапешт, Венгрия, под номером NCAIM (P) В 001268, или его мутантный штамм, который способен 6 3. Способ по п.1, в котором применяют штамм IDR-P4 Micromonospora purpurea, депонированный в Национальной коллекции сельскохозяйственных и промышленных микроорганизмов, Будапешт, Венгрия, под номером NCAIM (P) В 001271, или его мутантный штамм, который способен 6 4. Способ по п.1, в котором применяют штамм IDR-P5 Micromonospora echinospora ssp. echinospora, депонированный в Национальной коллекции сельскохозяйственных и промышленных микроорганизмов, Будапешт, Венгрия, под номером NCAIM (Р) В 001272, или его мутантный штамм, который способен 6 5. Способ по п.1, в котором применяют штамм IDR-P6 Micromonospora megalomicea ssp. nigra, депонированный в Национальной коллекции сельскохозяйственных и промышленных микроорганизмов, Будапешт, Венгрия, под номером NCAIM (P) В 001273, или его мутантный штамм, который способен 6 6. Способ по п.1, в котором применяют штамм IDR-P7 Micromonospora rosaria, депонированный в Национальной коллекции сельскохозяйственных и промышленных микроорганизмов, Будапешт, Венгрия, под номером NCAIM (P) В 001274, или его мутантный штамм, который способен 6 7. Способ по любому из пп.1-6, отличающийся тем, что соединение формулы (I), образованное во время ферментации, выделяют из культурального бульона путем абсорбции на анионообменной смоле. 8. Способ по любому из пп.1-6, отличающийся тем, что соединение формулы (I), образованное во время ферментации, выделяют в результате выполнения стадий, включающих в себя (а) экстрагирование не смешивающимся с водой органическим растворителем, (б) получение лактонного производного или его соли вторичного амина в качестве промежуточного соединения и (в) превращение промежуточного соединения в соединение формулы (I) под действием гидроокиси натрия или алкоксида натрия. 9. Способ по любому из пп. 1-6, отличающийся тем, что соединение формулы (I), образованное во время ферментации, выделяют в результате выполнения стадий, включающих в себя (а) экстрагирование несмешивающимся с водой органическим растворителем, (б) отделение щелочного водного экстракта и (в) хроматографию щелочного водного экстракта на неионной адсорбирующей смоле для выделения соединения формулы (I). MM4A – Досрочное прекращение действия патента СССР или патента Российской Федерации на изобретение из-за неуплаты в установленный срок пошлины за поддержание патента в силе
Дата прекращения действия патента: 30.06.2008
Извещение опубликовано: 20.07.2010 БИ: 20/2010
|
||||||||||||||||||||||||||