Патент на изобретение №2235776

(54) РЕКОМБИНАНТНАЯ ПЛАЗМИДНАЯ ДНК PLP-3,1, КОДИРУЮЩАЯ ПОЛИПЕПТИД ПРОИНСУЛИНА LYSPRO ЧЕЛОВЕКА, И ШТАММ БАКТЕРИЙ ESCHERICHIA COLI PLP-3-1/TG-1-ПРОДУЦЕНТ РЕКОМБИНАНТНОГО ПРОИНСУЛИНА LYSPRO

(57) Реферат:

Изобретение относится к генной инженерии, в частности к получению проинсулина Lyspro человека, и может быть использовано для создания лекарственных препаратов нового поколения для лечения инсулинозависимого сахарного диабета. Конструируют плазмиду pPL-3-1, кодирующую гибридный полипептид с последовательностью проинсулина Lyspro человека, в котором последовательность домена В стафилококкового белка А соединена через пептидный линкер HiS₆GlySerArg с аминокислотной последовательностью проинсулина Lyspro человека, с молекулярной массой 3,3 МДа (5051 п.о.), содержащей HindIII/BamHI-фрагмент плазмиды pPINS07, включающий гибридный tac-промотор, ген -лактамазы (bla), область начала репликации (ori), терминатор транскрипции рибосомного оперона E.coli, последовательность нуклеотидов, кодирующую последовательность аминокислот домена В белка A S. aureus, содержащую синонимическую замену СТ в положении 3 третьего кодона GAC, соединенную с последовательностью нуклеотидов, кодирующей пептид His₆GlySerArg, и HindIII/BamHI/-фрагмент (271 п.о.), кодирующий проинсулин Lyspro человека, сайты рестрикции со следующими координатами: EcoRI – 1, NcoI/ – 217, BamHI – 221, PstI – 342 и 417, HindIII – 492, SalGI – 4513, ClaI – 4792. Бактерии Escherichia coli трансформируют плазмидой pPL-3-1 и получают штамм Escherichia coli TG-1/pLP-3-1 – продуцент гибридного полипептида с последовательностью проинсулина Lyspro человека. Изобретение позволяет получить проинсулин Lyspro человека с высоким выходом и по упрощенной технологии. 2 н.п. ф-лы, 3 ил.

Изобретение относится к биотехнологии, в частности к генной инженерии, в частности к получению проинсулина Lyspro человека, и может быть использовано для создания лекарственных препаратов нового поколения для лечения инсулинозависимого сахарного диабета.

Известен способ получения инсулина Lyspro, в котором последовательность нуклеотидов, кодирующая А-цепь инсулина, была синтезирована химически и клонирована в экспрессирующем плазмидном векторе под контролем промотора гена триптофансинтетазы E.coli (trp LE’) в виде гибридного гена, включающего 5’-концевую часть гена -галактозидазы и соответствующую инсулиновую последовательность. Рекомбинантную плазмиду вводили с помощью трансформации в бактериальный штамм, где после индукции промотора происходил синтез гибридного белка следующей структуры: -gal-Met-A-цепь (где -gal – N-концевая часть -галактозидазы E.coli, a Met – метиониновый линкер). Наличие линкера позволяло производить расщепление химерного полипептида бромистым цианом в очищенных “тельцах включения”, с последующей хроматографической очисткой А-цепи. В-цепь инсулина, содержащую требуемую последовательность Lys(B28)-Рro(В29), получали твердофазным синтезом. Далее очищенные цепи инсулина объединяли in vitro и осуществляли окисление сульфгидрильных групп, что приводило к образованию дисульфидных связей между цепями. На конечных этапах проводили очистку полученного таким образом инсулина Lyspro [EP №0383472, МКИ С 07 К 7/40, 1990].

Способ имеет ряд недостатков, в частности высокую трудоемкость, низкий выход конечного продукта, что не дает возможность использования их в технологических целях.

Наиболее близким по технической сущности к предлагаемому изобретению является штамм-продуцент, в котором ген проинсулина человека, содержащий на N-конце два избыточных аминокислотных остатка Met-Tyr, клонировали в экспрессирующей векторной плазмиде под контролем промотора pL и температурочувствительного репрессора сI857 фага . В качестве селектируемого маркера использовали ген устойчивости к тетрациклину tetR. После термоиндукции рекомбинантного гена повышением температуры до 40С, образующийся рекомбинантный проинсулин накапливался в клетках E.coli в тельцах включения, из которых проводили его дальнейшую очистку. На первом этапе, используя катепсин С, отделяли избыточный дипептид Met-Tyr, на втором – С-пептид проинсулина отщепляли трипсином и карбоксипептидазой В с последующей очисткой образовавшегося аналога инсулина Lyspro [пат. США No 5514646, МКИ, 1996].

Задачей изобретения является конструирование плазмиды, детерминирующей синтез гибридного рекомбинантного белка, в котором единственный IgG-связывающий домен белка А соединен через пептидный линкер Hys₆AspGlyArg с аминокислотной последовательностью проинсулина Lyspro человека, то есть содержащего в положениях 28 и 29 полипептидной цепи остатки Lys и Pro, и создание высокопродуктивного бактериального штамма-продуцента, позволяющего получать инсулин Lyspro с высоким выходом и по упрощенной технологии.

Поставленная задача решается за счет конструирования рекомбинантной плазмидной ДНК pPL-3-1, кодирующей гибридный полипептид с последовательностью проинсулина Lyspro человека, в котором последовательность домена В стафилококкового белка А соединена через пептидный линкер His₆GlySerArg с аминокислотной последовательностью проинсулина Lyspro человека, с молекулярной массой 3,3 МДа (5051 п.о.), содержащей HindIII/ВаmHI-фрагмент плазмиды pPINS07, включающий гибридный tac-промотор, ген -лактамазы (bla), область начала репликации (ori), терминатор транскрипции рибосомного оперона E.coli, последовательность нуклеотидов, кодирующую последовательность аминокислот домена В белка A S. aureus, содержащую синонимическую замену СТ в положении 3 третьего кодона GAC, соединенную с последовательностью нуклеотидов, кодирующей пептид His₆GlySerArg, и НindIII/ВаmHI-фрагмент (271 п.о.), кодирующий проинсулин Lyspro человека, сайты рестрикции со следующими координатами: EcoRI – 1, NcoI – 217, ВаmHI – 221, PstI – 342 и 417, HindIII – 492, SalGI – 4513, ClaI – 4792, а также штамма Escherichia coli TG-1/pLP-3-1 – продуцента гибридного полипептида с последовательностью проинсулина Lyspro человека.

Исходной плазмидой для конструирования является плазмида pPINS07, кодирующая гибридный полипептид, состоящий из одного IgG-связывающего домена белка A Staphylococcus aureus, пептидного линкера His₆

Рекомбинантная плазмидная ДНК pLP-3-1, кодирующая гибридный полипептид с аминокислотной последовательностью аналога проинсулина Lyspro человека, характеризуется следующими признаками:

имеет молекулярную массу 3,3 МДа (5051 т.п.о.);

кодирует гибридный белок, в котором последовательность домена В стафилококкового белка А с С-концевым гексагистидиновым линкером соединена через трипептид GlySerArg с последовательностью проинсулина Lyspro человека;

-лактамазы (bla), определяющий устойчивость клеток бактерий к ампициллину, область инициации репликации плазмидной ДНК (ori)₁ терминатор транскрипции рибосомного оперона E.coli, a также включающего часть искусственного гена, кодирующую IgG-связывающий домен белка А из S. aureus, содержащую синонимическую замену С

Преимуществом полученной плазмиды pLP-3-1 перед известными плазмидами является то, что она кодирует полипептид проинсулина Lyspro под контролем синтетического tac-промотора, индуцируемого изопропил--D-тиогалактопиранозидом (ИПТГ). Это позволяет индуцировать и осуществлять синтез проинсулина при обычной для E.coli температуре 37С, что значительно повышает выход рекомбинантного белка и облегчает его дальнейшую очистку. Дальнейшее повышение выхода рекомбинантного проинсулина Lyspro достигнуто введением синонимической замены нуклеотида в 5’-концевой части экспрессирующейся кассеты рекомбинантных последовательностей нуклеотидов. Кроме того, в отличие от плазмиды-прототипа сконструированная плазмида содержит ген -лактамазы в качестве селектируемого маркера.

Для получения штамма-продуцента гибридного полипептида с проинсулином Lyspro человека рекомбинантную плазмиду pLP-3-1 вводят с помощью электропорации в компетентные клетки E.coli TG-1.

Полученный штамм Escherichia coli/pLP-3-1, названный E.coli LP31, характеризуется следующими признаками.

Морфологические признаки: клетки мелкие палочковидной формы, грамотрицательные, неспороносные, 13,5 мкм, подвижные.

Культуральные признаки: при росте на агаризованной среде LB колонии круглые, гладкие, полупрозрачные, блестящие, серые. Край ровный, диаметр колоний 1-3 мм, консистенция пастообразная. Рост в жидких средах (LB, минимальная среда с глюкозой) характеризуется ровным помутнением, осадок легко седиментирует.

Физико-биохимические признаки: клетки растут при 4-42С, оптимум рН 6,8-7,6. В качестве источника азота используют как минеральные соли аммония, так и органические соединения: аминокислоты, пептон, триптон, дрожжевой экстракт. В качестве источника углерода при росте на минимальной среде используют глицерин, углеводы, аминокислоты.

Устойчивость к антибиотикам: клетки штамма-продуцента проявляют устойчивость к ампициллину (до 300 мкг/мл) и хлорамфениколу (до 100 мкг/мл), обусловленную наличием генов устойчивости в ДНК рекомбинантной плазмиды pLP-3-1 и эписомной ДНК штамма-хозяина соответственно.

Изобретение иллюстрируется следующими примерами:

Пример 1. Получение фрагмента ДНК, кодирующего проинсулин Lyspro человека.

100 нг плазмидной ДНК pPINS07, содержащей ген природного проинсулина человека, используют в качестве матрицы для синтеза фрагмента А (фиг.2) в полимеразной цепной реакции (ПЦР), добавляя к 50 мкл реакционной смеси следующего состава: 20 мМ Трис-НСl, рН 8,8, 67 мМ (NH₄)₂SO₄, 1,5 мМ MgCl₂, по 0,2 мМ dATP, dCTP, TTP и dGTP каждого, 0,05 ед. Taq-ДНК-полимеразы и по 1 мкМ каждого из праймеров CAGGATCATCACCATGGATCCCG и CACGACGGGTCGGCTTGGTGTAGAAG (праймеры 1 и 4 соответственно на фиг.2, подчеркнута мутантная, мутагенизирующая последовательность). Амплификацию соответствующего участка плазмиды осуществляют, проводя 22 цикла ПЦР (94С, 20 с; 50С, 20 с; 72С, 20 с). Синтез фрагмента В (фиг.2) проводят в тех же условиях и в той же реакционной смеси, но в присутствии праймеров CCGCCAAGCTTACTAGTTGCAGTAG и ACACCAAGCCGACCCGTCGTGAAGC (праймеры 2 и 3, фиг.2). Синтезированные фрагменты А и В электрофоретически в 3% агарозном геле переносят на кусочки ДЭАЭ-мембраны NA-45 (Schleicher&Schuhle) и элюируют в центрифужных микропробирках на 1,5 мл 200 мкл буфера, содержащего 1,5 М NaCl, 10 мМ ЭДТА в течение 40 мин при 65С. К буферу добавляют тРНК Е.соli до конечной концентрации 100 мкг/мл и синтезированные фрагменты осаждают 2,5 объемами 96% этилового спирта. Осадок собирают центрифугированием на микроцентрифуге “Эппендорф” при максимальных оборотах в течение 15 мин, супернатант отбрасывают, осадки промывают 1 мл холодного 70% этилового спирта, подсушивают при комнатной температуре и растворяют в 50 мкл деионизованной воды. Сборку полного фрагмента С (фиг.2) осуществляют с помощью ПЦР в 25 мкл вышеописанной реакционной смеси, однако в отличие от нее содержащей по 1 мкл очищенных перекрывающихся фрагментов А и В в качестве матрицы, а также праймеры CAGGATCATCACCATGGATCCCG и CCGCCAAGCTTACTAGTTGCAGTAG (праймеры 1 и 2 на фиг.2). Для получения липких концов синтезированный фрагмент С инкубируют с эндонуклеазами рестрикции HindIII и BamHI (Fermentas, Латвия). По окончании инкубации фрагмент С, содержащий липкие концы, осаждают 96% этиловым спиртом, как описано выше, но не добавляя тРНК, промывают 70% спиртом, подсушивают и растворяют в 20 мкл воды.

Пример 2. Подготовка экспрессирующего вектора для клонирования синтезированного фрагмента С.

Пример 3. Получение плазмиды pLP-3-1, экспрессирующей ген гибридного проинсулина Lyspro человека и штамма-продуцента гибридного проинсулина Lyspro.

Т в положении 3 третьего кодона GAC 5’-концевой последовательности искусственного гена, кодирующей IgG-связывающий домен белка A S. aureus, которая, не изменяя последовательности аминокислот гибридного полипептида, приводит к повышению уровня его экспрессии в бактериальных клетках, возможно за счет увеличения стабильности его мРНК.

Пример 4. Определение продуктивности штамма-продуцента гибридного полипептида с проинсулином Lyspro человека.

В 20 мл жидкой среды LB, содержащей 100 мкг/мл ампициллина, вносят индивидуальную колонию клеток E.coli pLP-3-1/TG-1, содержащих плазмиду pLP-3-1, и выращивают при 37С на качалке при 180 об/мин в течение 4 ч до мутности 0,8. Затем добавляют индуктор ИПТГ до конечной концентрации 0,5 мМ и продолжают инкубацию в тех же условиях в течение 6 ч. Отбирают пробу 2 мл и центрифугируют 5 мин при 6000 об/мин, после чего клетки суспендируют в 200 мкл буфера, содержащего 125 мМ Трис-HCl, рН 6,8, 20% глицерин, 3% додецилсульфат натрия, 3% меркаптоэтанол и 0,01% бромфенолового синего, нагревают 10 мин на кипящей водяной бане. Отбирают образцы объемом 2,5, 5, 7,5, 10 и 15 мкл и анализируют электрофорезом в 13%-ном полиакриламидном геле, содержащем 0,1% додецилсульфат натрия. Гель окрашивают Кумасси R-250 и сканируют на лазерном денситометре Ultrascan XL. По данным сканирования гибридный полипептид составляет не менее 25-30% суммарного клеточного белка.

Формула изобретения

1. Рекомбинантная плазмидная ДНК pPL-3-1, кодирующая гибридный полипептид с последовательностью проинсулина Lyspro человека, в котором последовательность домена В стафилококкового белка А соединена через пептидный линкер His₆GlySerArg с аминокислотной последовательностью проинсулина Lyspro человека, с молекулярной массой 3,3 МДа (5051 п.о.), содержащая HindIII/BamHI-фрагмент плазмиды pPINS07, включающий гибридный tac-промотор, ген в-лактамазы (bla), область начала репликации (ori), терминатор транскрипции рибосомного оперона E.coli, последовательность нуклеотидов, кодирующую последовательность аминокислот домена В белка A S. aureus, содержащую синонимическую замену СТ в положении 3 третьего кодона GAC, соединенную с последовательностью нуклеотидов, кодирующей пептид His₆GlySerArg, и НindIII/ВаmHI/-фрагмент (271 п.о.), кодирующий проинсулин Lyspro человека, сайты рестрикции со следующими координатами: EcoRI- I, NcoI- 217, BamHI- 221, PstI-342 и 417, HindIII-492, SalGI-4513, ClaI-4792.

2. Штамм Escherichia coli TG-1/pLP-3 -1- продуцент гибридного полипептида с последовательностью проинсулина Lyspro человека.

РИСУНКИ