Патент на изобретение №2235481

(54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ БИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНОЙ ДОБАВКИ К ПИЩЕ (ВАРИАНТЫ)

(57) Реферат:

Изобретение относится к области пищевой промышленности и биотехнологии, а именно к способу получения биологически активной добавки (БАД) к пище из грибов, используемой для восстановления и укрепления иммунной системы человека. Предложен способ получения биологически активной добавки к пище, включающий выращивание грибов рода Fusarium на питательной среде, отделение биомассы от культуральной жидкости. При этом штаммы гриба рода Fusarium выбраны из ряда: Fusarium sambucinum ВКМ F-26109Д, F-165Д-ВСБ-916(PS-64), F 169Д-ВСБ-917, F-3051Д, F-3052Д, F-8427Д, F-199Д-52587, F-676Д-139С, а перед выращиванием готовят посевной материал. Сначала с 10-суточного косяка культуры Fusarium на картофельно-морковном агаре получают хламидоспоры. Хламидоспоры используют как инокулят для приготовления макроконидий, выращиваемых на 3,5Б сусла при 27С в течение 3 суток. Полученные макроконидии культивируют в тех же условиях в течение 20 часов с получением густого мицелия из мелких хлопьевидных колоний в качестве посевного материала. Отделенную от культуральной жидкости биомассу подвергают автолизу при температуре 35-45С в присутствии этанола и получают биологически активную добавку к пище, обогащенную новыми биологически активными соединениями. Как вариант, готовую биомассу подвергают действию литических ферментов, содержащих хитиназу. Изобретение позволяет благодаря предлагаемому способу подготовки посевного материала увеличить и стандартизовать выход биомассы до 12-13 г/л, увеличить выход БАС и обогатить композиции БАД новыми биологически активными соединениями, в частности энниатином. 2 н.п. ф-лы.

Изобретение относится к области пищевой промышленности и биотехнологии, а именно к способу получения биологически активной добавки (БАД) к пище из грибов, используемой для восстановления и укрепления иммунной системы человека.

Применяемые в настоящее время биологически активные средства, в частности БАДы, основаны главным образом на биологически активных веществах растений и животных.

Известна, например, БАД “косметическое масло” с экстрактами водоросли фукус и лекарственных трав [1], серия косметических добавок ИНАГ-МАРЕ, содержащая оливковое и соевое масло, сывороточный гликопротеин и хитозан, полученный из краба [2].

Из грибов биологически активные добавки применяются в более ограниченной сфере, например, известна БАД к пище, направленная на укрепление иммунной системы человека, обладающая общеукрепляющими, антиоксидантными и адаптогенными свойствами [3].

Наиболее близкой по технической сущности и достигаемому эффекту является способ получения БАД к пище, а также ее вариантов, на основе биологически активной субстанции, выделяемой, например, из грибов Fusarium sambucinum BKM F-3051Д [4] (прототип). Предложен способ выращивания этого гриба глубинным способом в жидкой питательной среде, содержащей источники углерода – 3-4%, азота – 0,2-0,3%, фосфора – 0,2-0,3% и микроэлементы – 0,07-0,08% в стерильных условиях при температуре 26-30C с перемешиванием и аэрацией в течение 36-72 часов. Биомассу гриба отделяют от жидкой среды и извлекают биологически активные субстанции органическим растворителем, а также используют жидкие среды, получаемые после отделения биомассы гриба (культуральную жидкость). Полученные этим способом БАД содержат такие биологически активные соединения (БАС), как липиды, в том числе фосфолипиды, убихинон Q10, ферменты с протеазной, коллагеназной, липазной и рибонуклеазной активностями, а также -глюкан [4].

Недостатком данного способа является низкий выход БАС, нестандартность ферментации, ограниченность штаммов-продуцентов и необходимость использования других штаммов грибов Fusarium sambucinum для создания БАД, содержащих новые биологически активные соединения.

Задачей предложенного изобретения является создание новых способов получения биологически активной добавки к пище.

Эта задача решается тем, что предлагается способ получения биологически активной добавки к пище, включающий выращивание грибов рода Fusarium на среде, содержащей источник углерода – 3-4%, азота – 0,2-0,3%, фосфора – 0,2-0,3% и микроэлементы – 0,07-0,08% в стерильных условиях при температуре 26-30C с перемешиванием и аэрацией в течение 36-72 часов, отделение биомассы от культуральной жидкости. При этом штаммы гриба рода Fusarium выбраны из ряда: Fusarium sambucinum ВКМ F-26109Д, F-165Д-ВСБ-916(PS-64), F 169Д-ВСБ-917, F-3051Д, F-3052Д, F-8427Д, F-199Д-52587, F-676Д-139С, а перед выращиванием готовят посевной материал следующим образом. Сначала с 10-суточного косяка культуры Fusarium на картофельно-морковном агаре получают хламидоспоры, затем их используют как инокулят для приготовления макроконидий. Макроконидии выращивают на 3,5Б сусла при 27С в течение 3 суток. Полученные макроконидии культивируют в тех же условиях в течение 20 часов с получением густого мицелия из мелких хлопьевидных колоний. Последние используют в качестве посевного материала, а отделенную от культуральной жидкости биомассу подвергают автолизу при температуре 35-45 С в присутствии этанола.

Как вариант, предлагается также способ получения биологически активной добавки к пище, включающий выращивание грибов рода Fusarium на среде, содержащей источник углерода – 3-4%, азота – 0,2-0,3%, фосфора – 0,2-0,3% и микроэлементы – 0,07-0,08% в стерильных условиях при температуре 26-30С с перемешиванием и аэрацией в течение 36-72 часов, отделение биомассы от культуральной жидкости. При этом штаммы гриба рода Fusarium выбраны из ряда: Fusarium sambucinum ВКМ F-26109Д, F-165Д-ВСБ-916(Р8-64), F 169Д-ВСБ-917, F-3051Д, F-3052Д, F-8427Д, F-199Д-52587, F-676Д-139С, перед выращиванием готовят посевной материал следующим образом. Сначала с 10-суточного косяка культуры Fusarium на картофельно-морковном агаре получают хламидоспоры, затем их используют как инокулят для приготовления макроконидий. Макроконидии выращивают на 3,5Б сусла при 27С в течение 3 суток. Полученные макроконидии культивируют в тех же условиях в течение 20 часов с получением густого мицелия из мелких хлопьевидных колоний. Последние используют в качестве посевного материала, а отделенную от культуральной жидкости биомассу подвергают действию литических ферментов, содержащих хитиназу.

Используемые в качестве продуцентов БАС штаммы гриба рода Fusarium – Fusarium sambucinum: ВКМ F-26109Д, F-165Д-ВСБ-916(РS-64), F 169Д-ВСБ-917, F-3051Д, F-3052Д, F-8427Д, F-199Д-52587, F-676Д-139С являются известными и депонированы Всесоюзной коллекцией промышленных микроорганизмов института “ВНИИгенетика” и Всесоюзной коллекцией микроорганизмов ИБФН АН СССР.

Технический результат настоящего изобретения состоит в стандартности ферментации, в повышении выхода биомассы и образуемых биологически активных соединений.

Приготовленный вышеуказанным способом посевной материал в дальнейшем обеспечивает максимальный выход биомассы (до 13,0 г/л) у указанных выше штаммов гриба рода Fusarium. Полученные вышеуказанными способами биологически активные добавки к пище содержат ферменты, полисахариды, энниатин.

Проведенные клинические испытания позволили установить, что кроме указанных в прототипе [4] применений, например очистки стенок сосудов от бляшек посредством стимуляции образования простагландинов и простациклинов, полученные в настоящем изобретении, БАД к пище могут быть использованы для коррекции нарушений кишечника больных, страдающих дисбактериозом, а также для профилактики язвенной болезни 12-перстной кишки и побочных явлений, появляющихся в ходе лечения по стандартным методам.

Изобретение иллюстрируется следующими примерами, которые, однако, не охватывают, а тем более не ограничивают весь объем притязаний данного изобретения. Пример 1 (вариант 1).

Сначала готовят посевной материал следующим образом. С 10-суточного косяка культуры Fusarium sambucinum ВКМ Р-26109Д на картофельно-морковном агаре получают хламидоспоры. Полученную суспензию хламидоспор используют как инокулят для приготовления макроконидий, при этом хламидоспорами засевали колбу вместимостью 250 мл с 30 мл 3,5Б сусла и проводили культивирование на качалке с 220 об/мин при 27С в течение 3 суток. Приготовленные Макроконидии в количестве 3-5% вносили в колбу вместимостью 250 мл с 30 мл 3,5Б сусла и культивировали на качалке с 220 об/мин при 27С в течение 20 часов. Полученный посевной материал, представляющий собой густой мицелий из мелких хлопьевидных колоний, использовали в качестве жидкого инокулята (10% по объему) для засева производственной среды в ферментере. Выращивание посевного материала в ферментере проводили на среде F следующего состава (г/л): сахароза (сахар) – 30; NaNO₃ – 3; К₂НРO₄ – 1; MgSO₄ – 0,5; FeSO₄ – 0,01; KCL – 0,5; Н₂О водопроводная. После культивирования в течение 45 часов был получен оптимальный выход биомассы – 12,9 г/л. Биомасса была представлена густым беловатым хлопьевидным мицелием. После отделения культуральной жидкости от биомассы, последнюю подвергают автолизу при температуре 45С в присутствии этанола 10 мл/кг при влажности 80%. В результате получают биологически активную добавку, содержащую новые биологически активные соединения:

общие липиды, экстрагируемые по методу Фолча – 10-30%, в том числе 12-24% полярных липидов и 76-88% нейтральных липидов, при этом жирно-кислотный состав общих липидов следующий (% от суммы липидов): Пальмитиновая (C_16:0) – 19,8, Пальмитоолеиновая (C_16:1) – 1,3, Стеариновая (C_18:0) – 7,2, Олеиновая (C_18:1) – 36,0, Линолевая (C_18:2) – 25,5, Линоленовая (C_18:3) – 6,4, Эруковая (С_22:1) – 3,8. Основными компонентами нейтральных липидов являются триацил-глицерины (40-50%), стерины (10-20%) и эфиры стеринов (10-15%), минорными – моноацилглицерины, диацилглицерины и свободные жирные кислоты. Полярные липиды биомассы представлены гликолипидами и фосфолипидами, последние состоят из фосфатидилхолина (около 50-60% от суммы фосфолипидов), фосфатидилэтаноламина (около 30-40%) и фосфатидилсерином (около 10%);

коллагеназа – 1500-2500 ед./мл, протеаза – 2-3,5 ед./мл, пектиназы – 1-2 ед./мл.

Кроме того, в мицелии гриба содержится до 100-800 мг/л энниатина В (антибиотик, относимый к группе мембранных ионофоров), который по мере развития гриба переходит в среду выращивания.

В следующих примерах 2, 3 представлены способы получения посевного материала при меньшем, по сравнению с заявленным, времени культивирования хламидоспор.

Пример 2

То же, что и в примере 1, но при приготовлении посевного материала хламидоспоры выращивают на среде F с добавлением 10% сусла в течение 48 часов (2 суток) с получением макроконидии. Для выращивания вносят в ферментер 3-4% посевного материала. Выход сухой биомассы – до 7,0-7,5 г/л. При этом содержание БАС, в частности коллагеназы, снижается в 1,5-2 раза.

Пример 3

То же, что и в примере 1, но при приготовлении посевного материала хламидоспоры (взятые с 10-суточного косяка на картофельно-морковном агаре) выращивают в течение 24 часов (1 сутки) с получением макроконидий. Выход биомассы составляет 5,7 г/л. Содержание БАС, в частности коллагеназы, снижается в 1,5-2,1 раза.

Таким образом, из примеров 2 и 3 видно, что при приготовлении посевного материала, в частности при выращивании хламидоспор с получением макроконидий, в течение менее 3 суток (по сравнению с примером 1) наблюдается снижение выхода биомассы и обеднение готовых БАД биологически активными соединениями.

Пример 4 (вариант 2).

Посевной материал готовят следующим образом. С 10-суточного косяка культуры Fusarium sambucinum BKM F-676Д-139С на картофельно-морковном агаре получают хламидоспоры. Полученной суспензией хламидоспор засевали колбу вместимостью 250 мл с 30 мл 3,5Б сусла и проводили культивирование на качалке с 220 об/мин при 27С в течение 3 суток. Приготовленные макроконидии в количестве 3-5% вносили в колбу вместимостью 250 мл с 30 мл 3,5Б сусла и культивировали на качалке с 220 об/мин при 27С в течение 20 часов. Полученный посевной материал, представляющий собой густой мицелий из мелких хлопьевидных колоний, использовали в качестве жидкого инокулята (10% по объему) для засева производственной среды в ферментере. Выращивание посевного материала в ферментере проводили на среде F следующего состава, г/л: сахароза (сахар) – 30; NaNО₃ – 3; К₂НРO₄ – 1; MgSO₄ – 0,5; FeSO₄ – 0,01; KCL – 0,5; H₂O водопроводная. После культивирования в течение 45 часов был получен оптимальный выход биомассы – 13,0 г/л. Выращенную биомассу отделяют от культуральной жидкости и подвергают действию литических ферментов, содержащих хитиназу. Полученная БАД содержит биологически активные соединения, такие как коллагеназу – 2500-3500 ед/мл, протеазу 3-4 ед/мл, пектиназу 2-3 ед/мл, полисахариды 5-10 мг/мл.

Таким образом, заявленное изобретение позволяет благодаря предлагаемому способу подготовки посевного материала увеличить и стандартизовать выход биомассы до 12-13 г/л, увеличить выход БАС и обогатить композиции БАД новыми биологически активными соединениями, в частности энниатином.

Литература

2. Концепция ИНАГ-ФАРМА “ИНАГ: косметика + биодобавки”. Теоретические основы и практические подходы. Москва. 2001.

Формула изобретения

1. Способ получения биологически активной добавки к пище, включающий выращивание грибов рода Fusarium на среде, содержащей источник углерода 3-4%, азота 0,2-0,3%, фосфора 0,2-0,3% и микроэлементы 0,07-0,08% в стерильных условиях при температуре 26-30°С с перемешиванием и аэрацией в течение 36-72 ч, отделение биомассы от культуральной жидкости, отличающийся тем, что штаммы гриба рода Fusarium выбраны из ряда: Fusarium sambucinum BKM F-26109Д, F-165Д-ВСБ-916(PS-64), F-169Д-ВСБ-917, F-3051Д, F-3052Д, F-8427Д, F-199Д-52587, F-676Д-139С, перед выращиванием готовят посевной материал, при этом сначала с 10-суточного косяка культуры Fusarium на картофельно-морковном агаре получают хламидоспоры, затем их используют как инокулят для приготовления макроконидий, выращиваемых на 3,5°Б сусла при 27°С в течение 3 суток, полученные макроконидии культивируют в тех же условиях в течение 20 ч с получением густого мицелия из мелких хлопьевидных колоний в качестве посевного материала, а отделенную от культуральной жидкости биомассу подвергают автолизу при температуре 35-45°С в присутствии этанола.

2. Способ получения биологически активной добавки к пище, включающий выращивание грибов рода Fusarium на среде, содержащей источник углерода 3-4%, азота 0,2-0,3%, фосфора 0,2-0,3% и микроэлементы 0,07-0,08% в стерильных условиях при температуре 26-30°С с перемешиванием и аэрацией в течение 36-72 ч, отделение биомассы от культуральной жидкости, отличающийся тем, что штаммы гриба рода Fusarium выбраны из ряда: Fusarium sambucinum BKM F-26109Д, F-165Д-ВСБ-916(PS-64), F 169Д-ВСБ-917, F-3051Д, F-3052Д, F-8427Д, F-199Д-52587, F-676Д-139С, перед выращиванием готовят посевной материал, при этом сначала с 10-суточного косяка культуры Fusarium на картофельно-морковном агаре получают хламидоспоры, затем их используют как инокулят для приготовления макроконидий, выращиваемых на 3,5°Б сусла при 27°С в течение 3 суток, полученные макроконидии культивируют в тех же условиях в течение 20 ч с получением густого мицелия из мелких хлопьевидных колоний в качестве посевного материала, а отделенную от культуральной жидкости биомассу подвергают действию литических ферментов, содержащих хитиназу.