|
(21), (22) Заявка: 2003106823/12, 13.03.2003
(24) Дата начала отсчета срока действия патента:
13.03.2003
(45) Опубликовано: 27.08.2004
(56) Список документов, цитированных в отчете о поиске:
ХАЗИЕВ Ф.Х. Ферментативная активность почв. – М.: Наука, 1976, с. 179. ХАЗИЕВ Ф.Х. Системно-экологический анализ ферментативной активности почв. – М.: Наука, 1982, с.203. RU 2075933 C1, 27.03.1997. RU 2092547 С1, 10.10.1997.
Адрес для переписки:
141005, Московская обл., г. Мытищи-5, МГУЛ, патентный отдел
|
(72) Автор(ы):
Федотов Г.Н. (RU), Неклюдов А.Д. (RU), Горшкова О.В. (RU), Пахомов Е.И. (RU), Поздняков А.И. (RU), Олиференко Г.Л. (RU)
(73) Патентообладатель(и):
Московский государственный университет леса (RU)
|
(54) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ СКОРОСТИ ГИДРОЛИЗА ЛИПИДОВ ЛИПАЗОЙ В ПОЧВАХ
(57) Реферат:
Изобретение относится к сельскому хозяйству и почвоведению, а именно к методам оценки биологической активности и почвенного плодородия по ферментативной активности почв. Способ заключается в определении скорости образования жирных кислот при взаимодействии липидов с почвой. Перед внесением в почву липиды переводят в порошкообразное состояние загущением гидрофильным аэросилом при содержании последнего 70-80 вес.%. Изобретение позволяет оценивать биологическую активность липазы и скорость ферментативной реакции в реальных почвенных условиях. 1 табл.
Изобретение относится к сельскому хозяйству и почвоведению, а именно к методам оценки биологической активности и почвенного плодородия по ферментативной активности почв.
Известен способ определения липазной активности почв [1], заключающийся в гидролизе трибутирина в водном растворе суспензии почвы. Согласно методу В. Покорной к навеске (0,5 г) почвы добавляют 1,5 мл толуола, через 15 минут – 9 мл дистиллированной воды и 1 мл трибутирина. Смесь инкубируют в течение 72 часов при 37 С, добавляют 40 мл спиртоэфирной смеси (1:1) и взбалтывают. Суспензию отстаивают или фильтруют. В фильтрате определяют содержание образовавшейся масляной кислоты щелочным титрованием. Активность липазы выражают в мл 0,05 н. раствора гидрооксида натрия в пересчете на 0,5 г почвы.
Основным недостатком данного способа является определение скорости ферментативной реакции гидролиза трибутирина не в реальных почвенных условиях (влажность почвы, рН, состав почвенного поглощающего комплекса, содержание свободных солей, содержание органики и т.д.), в которых она протекает, а в суспензии почвы в растворе трибутирина. Такой подход позволяет с определенным приближением характеризовать количество ферментов в почве [2, 3], но не дает возможности определять активность липазы в почвенных условиях и делать выводы о скорости ферментативной реакции в реальности.
Наиболее близким к заявляемому является метод, основанный на изучении гидролиза растительного масла [1]. В соответствии с этим методом 5 г почвы помещают в колбу, обрабатывают 2 мл толуола и оставляют на 15 минут. Затем добавляют 5 мл дистиллированной воды, 5 мл ацетатного буфера (рН 7,0) и 2,5 мл растительного масла. Смесь помещают в термостат для инкубации на 72 часа при 30 С. После инкубации к суспензии добавляют 10 мл 96% этанола, фильтруют и 10 мл субстрата титруют 0,1 н. спиртовым раствором гидрооксида калия в присутствии индикатора фенолфталеина. Активность липазы выражают в мл 0,1 н. раствора гидрооксида калия на 1 г почвы.
Недостатки данного метода также заключаются в проведении опыта в суспензии почвы, а не в самой почве, что не позволяет изучать влияние состава и физико-химических свойств почв на активность липазы в почвах и скорость ферментативной реакции. Отметим, что в отличие от концентрации активность ферментов может в десятки раз меняться при изменении рН или ионной силы почвенных растворов, степени иммобилизации и других факторов, обусловленных свойствами почв. Поэтому получение данных, характеризующих концентрацию ферментов недостаточно информативно, не позволяет однозначно характеризовать биологическую активность почв.
Целью изобретения является определение скорости гидролиза липидов липазой в реальных почвенных условиях. Данный параметр является одной из характеристик почвенной биологической активности и почвенного плодородия [4, 5].
Технической задачей изобретения является диспергирование липидов и равномерное распределение их в почве.
Поставленная задача решается введением в липид гидрофильного аэросила при его содержании 70-80 вес. % и переводе липида в порошкообразное состояние.
Техническая сущность изобретения заключается в переводе липида в порошок, обладающий большей степенью гидрофильности по сравнению с липидом, путем загущения его гидрофильным аэросилом при содержании аэросила в смеси 70-80 вес. % и тщательной гомогенизации полученной смеси в ступке. После приготовления навеска аэросильной смеси помещается в емкость, в которой уже находится почва, и перемешивается с ней. Отбор проб из смеси берут через 72 часа и определяют содержание органических кислот по стандартной для почв методике. Скорость гидролиза липидов липазой в почвах выражают в мл 0,1 н. раствора гидрооксида калия на 1 г почвы за 72 часа.
Предлагаемый способ исключает неопределенность перенесения данных по активности липазы в суспензии почвы на активность липазы в почве, так как позволяет проводить испытания непосредственно в почвах. Еще более важным достоинством способа является возможность проводить изучение влияния на скорость ферментативной реакции и биологическую активность почв различных внешних воздействий, что по существующим методикам невозможно в принципе.
Нижеследующие примеры раскрывают суть предлагаемого изобретения.
Пример 1
Эксперименты показывают, что при содержании аэросила А-380 (размер частиц 10-40 нм) в аэросильной смеси меньше 70% не удается равномерно распределить липиды в почве. В результате получаются заниженные значения по скорости ферментативной реакции.
Пример 2
При содержании аэросила А-380 в аэросильной смеси больше 80% количество аэросильной смеси при одном и том же отношении липид – почва становится слишком большим. Это искажает структуру почвы, изменяет ее насыпной вес. Проведение испытаний в таких смесях теряет смысл, так как это уже не почвы.
Пример 3
При содержании аэросила А-380 в аэросильной смеси 70-80 вес. % удается получить гомогенные смеси с почвой при незначительном изменении насыпного веса почвы. Для определения активности липазы в тепличном грунте брали 20 г почвы, помещали в чашку Петри. Туда же помещали навеску АС 0,83 (70%) или 1,25 (80%) г, соответствующую одинаковому содержанию липида (0,25 г) в почвенной смеси. Аэросильные смеси готовили введением аэросила А-380 в растительное масло и тщательно перетирали в ступке. Образцы тепличного грунта, содержащие аэросильные смеси, оставляли на 72 часа при комнатной температуре 23-24 С. После этого проводили определение содержания органических кислот в почве по стандартной методике. Для сравнения определили липазную активность тепличного грунта по методике, являющейся ближайшим аналогом, и для возможности их сравнения отнесли полученные данные на 1 г субстрата (см. таблицу).
Полученные результаты свидетельствуют, что между скоростью ферментативной реакции, определенной в реальных почвенных условиях (заявляемый способ) и в суспензии (ближайший аналог), существует более чем трехкратное расхождение, причем в суспензии реакция протекает медленнее, несмотря на то, что проводится не при комнатной температуре, а при 30 С. Это позволяет сделать вывод о том, что суспензионный метод определения активности липазы позволяет получать только оценочные данные по скорости ферментативной реакции в почве.
Таким образом, изобретение позволяет:
1. определять активность липазы и скорость ферментативной реакции в реальных почвенных условиях, а следовательно, корректно оценивать их биологическую активность;
2. изучать влияние свойств почв на скорость гидролиза липидов липазой в них;
3. определять влияние внешних факторов воздействия на скорость ферментативной реакции.
Литература
1. Хазиев Ф.Х. Ферментативная активность почв. М.: Наука, 1976. 179 с.
2. Хазиев Ф.Х. Системно-экологический анализ ферментативной активности почв. М.: Наука, 1982, 203 с.
3. Звягинцев Д.Г. Проблемы биохимии почв. – Вестн. МГУ. Сер. 17, 1977, №1, с.74-84.
4. Кольцова О.М., Стекольников К.Е., Казанджьян П.К. Ферментативная активность как метод диагностики плодородия почв. – Мелиорация и водное хозяйство. 1993, №2, с.29-31.
5. Михайловская Н.А. Ферментативная активность как показатель плодородия дерново-подзолистой легкосуглинистой почвы. Автореф. дис. канд. с-х наук. Минск, 1988, 17 с.
Формула изобретения
Способ определения скорости гидролиза липидов липазой в почвах, заключающийся в определении скорости образования жирных кислот при взаимодействии липидов с почвой, отличающийся тем, что липиды перед внесением в почву переводят в порошкообразное состояние загущением гидрофильным аэросилом при содержании последнего 70-80 вес.%.
MM4A Досрочное прекращение действия патента Российской Федерации на изобретение из-за неуплаты в установленный срок пошлины за поддержание патента в силе
Дата прекращения действия патента: 14.03.2005
Извещение опубликовано: 10.12.2006 БИ: 34/2006
|
|