Патент на изобретение №2234312

(54) СПОСОБ ВОССТАНОВЛЕНИЯ КОЖНОГО ПОКРОВА

(57) Реферат:

Изобретение относится к области медицины, в частности к экспериментальной медицине. Способ обеспечивает сокращение сроков восстановления кожного покрова, а также повышает эффективность использования растворов, защиту трансплантата от высыхания и механических повреждений. Проводят трансплантацию клеток на субстратном комплексе в виде губки на реципиентную поверхность с последующим воздействием на трансплантат питательной средой, при этом губку закрепляют на раневой поверхности и с областью повреждения заключают в изолятор, длительно и непрерывно заполненный периодически сменяемой культуральной средой, одномоментно губку инфильтрируют суспензией из мелких фрагментов кожи, а через 20 часов пересаживают аутоклетки эпидермиса и дермы и далее их культивирование проводят непосредственно на субстрате, закрепленном на реципиентной поверхности животного.

Способ относится к области медицины, а именно к экспериментальной медицине.

Однако этот известный способ имеет очевидные недостатки:

1) орошение раны не позволяет обеспечить длительное равномерное омывание трансплантата растворами с питательными веществами и факторами роста, а также не исключает высыхание клеток на субстратном комплексе;

2) орошение раны ведет к повышенному расходу растворов с питательными веществами и факторами роста;

3) испарение воды при орошении изменяет концентрацию растворенных веществ и осмолярность растворов;

4) выливаемые растворы ведут к намоканию животного и его переохлаждению, питательные вещества задерживаются вокруг трансплантата и создают условия для роста микроорганизмов, что увеличивает вероятность развития инфекционного воспаления;

5) орошающая повязка не исключает механические повреждения пересаженного комплекса при движениях животного и засорения трансплантата инородными телами;

6) предварительное культивирование клеток в питательной среде на субстрате in vitro, а также дальнейшая трансплантация комплекса на реципиентную поверхность и период его васкуляризация in vivo ведут к суммированию времени протекания идущих последовательно процессов подготовки трансплантата, его пересадки с непосредственным закрытием раневой поверхности и периодом васкуляризации трансплантата, что замедляет сроки лечения и при обширных повреждениях не способствует сохранению жизни пострадавшего.

Техническим результатом заявляемого изобретения является сокращение сроков восстановления кожного покрова, повышение эффективности использования растворов, их экономия, защита трансплантата от высыхания и механических повреждений, а также профилактика инфекционных осложнений.

Сущность изобретения состоит в том, что раневая поверхность сразу покрывается коллагеновой губкой, которая закрепляется на раневой поверхности и вместе с областью повреждения заключается в изолятор, длительно и непрерывно заполненный периодически сменяемой культуральной средой с химиотерапевтическими средствами, одномоментно с погружением в питательную среду губку инфильтрируют суспензией взвешенных фрагментов тканей и клеточных конгламератов, через 15-20 часов коллагеновую губку инфильтрируют суспензией, содержащей преимущественно взвесь фибробластов и их кластеров. Далее на поверхность губки, окруженной водонепроницаемым барьером, наносят слой взвеси эпителиальных клеток и их кластеров, причем поверхность губки должна находиться в горизонтальном положении не менее 6 часов. За этот промежуток эпителиальные клетки прикрепляются к субстрату. Далее культивирование пересаженных клеток проводят в условиях помещения восстанавливаемого участка кожи в водную среду изолятора непосредственно на субстрате (коллагеновой губке), заякоренном на реципиентной поверхности животного.

Пример использования.

Эксперимент был проведен на 10 половозрелых беспородных белых крысах-самках массой 170-180 г. Под нембуталовым наркозом у животных проводили выщипывание шерсти. Все тело животного обрабатывали химическим антисептиком АХД-2000 специаль. Далее область промежности окружалась специальным моче- и калоприемником. Всем животным в условиях операционной наносились стандартные полнослойные раны кожи боковой поверхности туловища размерами 4,04,0 см. На раневую поверхность сразу помещалась гемостатическая коллагеновая губка производства Лужского завода “Белкозин” толщиной 2 мм и подшивалась к поверхностной фасции тонкими шелковыми нитями. Затем тело наркотизированного животного за исключением головы погружалось в горизонтальном положении в эмалированный лоток, заполненный сбалансированным солевым раствором Хэнкса. Из лоскута иссеченной кожи этой крысы выделялись участки размером 0,50,5 см и 1,01,0 см. Их освобождали от подкожного жирового слоя и проводили механическое измельчение под бинокулярным увеличением глазными ножницами на тонкие полоски шириной 0,1-0,3 мм. Причем полоски ткани, полученные из первого участка, подвергали дальнейшему измельчению с помощью вращающихся лезвий на мельчайшие кусочки. Затем фрагменты тканей измельченных участков кожи помещали в 0,25% раствор трипсина (“Gibco”). Причем фрагменты первого участка помещали в раствор фермента на 5 ч при температуре +18С при постоянном покачивании, а второго – на 20 ч при температуре +4₃) в концентрации 0,35 г/л, метронидазол (10 мг/л) и пефлоксацин (10 мг/л).

Далее по известной методике (Парамонов Б.А., Порембский Я.О., Яблонский В.Г. Ожоги: Руководство для врачей. СПБ.: СпецЛит, 2000, – 480 с.) полоски кожи второго участка дважды промывали в растворе Хэнкса и под бинокулярным увеличением в чашке Петри отделяли микроинструментами дерму от эпидермиса. После отделения эпидермиса от дермы кусочки эпидермиса помещают к пробирку со смесью фосфатного буферного раствора (PBS) и 0,25% раствора трипсина в соотношении 1:1. Далее полоски помещают на термостатирующую “качалку” с частотой 40 колебаний в минуту при температуре +37С на 12 мин. Для остановки действия фермента добавляли бычью сыворотку из расчета 5% от общего объема и выдерживали в течение 10-15 мин при комнатной температуре. Пробирку с эпидермисом 10 раз сильно встряхивают, полученный раствор отбирали пипеткой с отбитым носиком и фильтровали через воронку с нейлоновым фильтром в другую пробирку. Взвесь клеток центрифугировали в течение 5 мин при 1000 об/мин. Супернатант сливали, осадок разводили ростовой средой, диспергировали и переносили на поверхность коллагеновой губки. Для этого лабораторную крысу предварительно наркотизировали и помещали в эмалированный лоток, заполненный подогретым до 37С раствором Хэнкса. Область пересадки окружали по краю водонепроницаемым барьером, стенки которого препятствуют растеканию раствора, основание барьера герметично крепили к интактной коже. Далее животное переносили в устройство “Регенератрон” до полного восстановления кожи.

Пример 2.

Эксперимент был проведен на 10 половозрелых беспородных белых крысах-самках массой 170-180 г. Под нембуталовым наркозом у животных в теплой воде с мылом мыли хвост, затем обрабатывали химическим антисептиком АХД-2000 специаль кожу хвоста. Всем крысам в условиях операционной наносились стандартные полнослойные опоясывающие раны кожи хвоста длиной 1,5 см. На раневую поверхность сразу помещалась гемостатическая коллагеновая губка производства Лужского завода “Белкозин” толщиной 2 мм и подшивалась к сухожилиям хвостового отдела позвоночника тонкими шелковыми нитями. Причем края губки укладывали под край раны. Затем животное заключалось в специальное устройство с емкостью-изолятором, обеспечивающее длительное непрерывное погружение хвоста в раствор и изоляцию хвоста с областью повреждения от внешней среды. Первоначально емкость-изолятор заполнялась солевым раствором Хэнкса. Из лоскута иссеченной кожи этой крысы выделялся участок размером 0,50,5 см. Далее проводили механическое измельчение под бинокулярным увеличением глазными ножницами на тонкие полоски шириной 0,1-0,3 мм. Половину количества полосок подвергали дальнейшему измельчению с помощью вращающихся лезвий на мельчайшие кусочки. Затем фрагменты тканей измельченных участков кожи помещали в 0,25% раствор трипсина (“Gibco”). Причем фрагменты первой порции помещали в раствор фермента на 5 ч при температуре +18С при постоянном покачивании, а второй – на 20 ч при температуре +4С. По прошествии времени воздействия раствора трипсина на фрагменты тканей первой порции проводили инфильтрацию губки готовой суспензией с помощью шприца. Емкость-изолятор была постоянно заполнена (до второго этапа пересадки) сменяемым 3 раза в сутки сбалансированным солевым раствором Хэнкса (модифицированным), куда также добавляли глюкозу до концентрации 1 г/л, соду (NaHCO₃) в концентрации 0,35 г/л, метронидазол (10 мг/л) и пефлоксацин (10 мг/л).

Далее фрагменты второй порции отмывали в растворе Хэнкса и под бинокулярным увеличением в чашке Петри отделяли микроинструментами дерму от эпидермиса. После отделения эпидермиса от дермы кусочки эпидермиса помещали в пробирку со смесью фосфатного буферного раствора (PBS) и 0,25% раствора трипсина в соотношении 1:1. Далее полоски помещали на термостатирующую “качалку” с частотой 40 колебаний в минуту при температуре +37С на 12 мин. Для остановки действия фермента добавляли бычью сыворотку из расчета 5% от общего объема и выдерживали в течение 10-15 мин при комнатной температуре. Пробирку с эпидермисом 10 раз сильно встряхивали, полученный раствор отбирали пипеткой с отбитым носиком и фильтровали через воронку с нейлоновым фильтром в другую пробирку. Взвесь клеток центрифугировали в течение 5 мин при 1000 об/мин. Супернатант сливали, осадок разводили ростовой средой, диспергировали и переносили на поверхность коллагеновой губки. Область пересадки окружали по краю водонепроницаемым барьером, стенки которого препятствовали растеканию раствора, основание барьера герметично крепили к интактной коже. В дальнейшем до полного восстановления кожи емкость-изолятор была постоянно заполнена ростовой средой, состоящей из смеси сред DMEM и F12 в отношении 3:1 с добавлением 10% сыворотки крупного рогатого скота, гентамицнна, метронидазола и пефлоксацина. Смена среды осуществлялась 3 раза в сутки с соблюдением правил антисептики.

Формула изобретения

Способ восстановления кожного покрова, включающий трансплантацию клеток на субстратном комплексе в виде губки на реципиентную поверхность, с последующим воздействием на трансплантат питательной средой, отличающийся тем, что губку закрепляют на раневой поверхности и с областью повреждения заключают в изолятор, длительно и непрерывно заполненный периодически сменяемой культуральной средой, одномоментно губку инфильтрируют суспензией из мелких фрагментов кожи, а через 20 ч пересаживают аутоклетки эпидермиса и дермы и далее их культивирование проводят непосредственно на субстрате, закрепленном на реципиентной поверхности животного.

MM4A Досрочное прекращение действия патента Российской Федерации на изобретение из-за неуплаты в установленный срок пошлины за поддержание патента в силе

Дата прекращения действия патента: 21.01.2005

Извещение опубликовано: 10.12.2006 БИ: 34/2006