Патент на изобретение №2232584
|
||||||||||||||||||||||||||
(54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ МИЕЛОПИДА
(57) Реферат: Изобретение относится к медицине, а именно к способам получения биологически активных препаратов из костного мозга животных. Способ включает приготовление суспензии клеток костного мозга, их инкубирование в питательной среде, отделение супернатанта и последующее выделение из него целевого продукта, при этом для суспендирования и инкубирования клеток используют неокрашенную среду, а выделение целевого продукта осуществляют путем пропускания супернатанта через биоспецифический сорбент Адан и экстрагирования адсорбированного материала 50-80% раствором этилового спирта в 0,1% водном растворе уксусной кислоты. Приведен состав предпочтительного варианта питательной среды. Способ позволяет увеличить выход целевого продукта при упрощении технологии производства и сокращении трудозатрат. 1 з.п. ф-лы, 1 табл. Изобретение относится к технологии получения иммуномодулирующего препарата из костного мозга животных. Известен способ получения Миелопида, включающий приготовление суспензии клеток костного мозга в окрашенной 199 среде, их инкубирование в той же среде, отделение супернатанта и выделение из него целевого продукта путем последовательного проведения ультрафильтрации, лиофильной сушки, растворения в стерильной воде, стерильной фильтрации и гель-хроматографического разделения на сефадексе G-25 с использованием фосфатного буфера (RU 2041716 С1, 20.08.1995). Недостатками этого способа являются высокая трудоемкость и сложность технологии, связанные с необходимостью очистки целевого продукта от используемого при суспендировании и инкубировании клеток красителя фенолового красного, входящего в состав 199 среды, и низкий выход целевого продукта, составляющий 250-300 доз из 1·1010 клеток. Техническим результатом изобретения является сокращение трудозатрат, упрощение технологии и увеличение выхода целевого продукта. Этот результат достигается тем, что в способе получения Миелопида, включающем приготовление суспензии клеток костного мозга, их инкубирование в питательной среде, отделение супернатанта и последующее выделение из него целевого продукта, согласно изобретению для суспендирования и инкубирования клеток используют неокрашенную среду, а выделение целевого продукта осуществляют путем пропускания супернатанта через биоспецифический сорбент Адан и экстрагирования адсорбированного материала водным раствором этилового спирта в уксусной кислоте. Предпочтительным вариантом воплощения настоящего изобретения предусмотрено использование для суспендирования и инкубирования среды, содержащей следующие компоненты, мг/дм3: CaCl2 200 Fe(NO3)2·9H2O 0,1 KCl 400 MgSO4·7Н2O 200 NaCl 6800 NaHCO3 2200 NaH2PO4·H2O 140 Аденин 10 Натриевая соль аденинтрифосфата 10 Адениновая кислота 0,2 Холестерол 0,2 2-деоксирибоза 0,5 Глюкоза 1000 Глутатион 0,05 Гуанин хлорид 0,3 Гипоксантин 0,3 Рибоза 0,5 Ацетат натрия 50 Тимин 0,3 Твин 80 20 Урацил 0,3 Ксантин 0,3 DL-аланин 50 L-аргинин хлорид 70 DL-аспарагиновая кислота 50 L-цистеин хлорид 0,1 L-цистидин 20 L-глутамин 100 DL-глутаминовая кислота·H2O 150 Глицин 50 L-гистидин хлорид 20 L-гидроксипролин 10 DL-изолейцин 40 DL-лейцин 120 L-лизин хлорид 70 DL-фенилаланин 50 DL-метионин 50 L-пролин 40 DL-серин 50 DL-треонин 60 DL-триптофан 20 L-тирозин 40 DL-валин 50 р-аминобензойная кислота 0,05 Аскорбиновая кислота 0,05 Биотин 0,01 Кальциферол 0,1 Холин хлорид 0,5 Фолиевая кислота 0,01 i-инозитол 0,05 Менадион 0,01 Никотинамид 0,025 Никотиновая кислота 0,025 Натриевая соль пантотеновой кислоты 0,01 Пиридоксал хлорид 0,025 Пиридоксин хлорид 0,025 Рибофлавин 0,01 Тиамин хлорид 0,01 п-токоферолфосфат натрия 0,01 Витамин А 0,1 Другим предпочтительным вариантом предусмотрено использование 50-80% раствора этилового спирта в 0,1% водном растворе уксусной кислоты. Способ реализуется следующим образом. Клетки костного мозга извлекают из измельченных костей животных путем суспендирования в жидкой неокрашенной среде с последующей фильтрацией, центрифугированием и разбавлением неокрашенной питательной средой, содержащей смесь витаминов, аминокислот и компонентов нуклеиновых кислот в солевом растворе Хенкса, предпочтительно в указанном выше соотношении компонентов. Затем осуществляют инкубирование клеток при традиционных параметрах процесса и отделяют супернатант центрифугированием. Из супернатанта выделяют целевой продукт путем его адсорбции на биоспецифическом сорбенте Адан (ТУ 6-02-98-94) с последующим экстрагированием водным раствором этилового спирта в уксусной кислоте, предпочтительно с концентрацией этилового спирта 50-80% по объему в 0,1% по объему водном растворе уксусной кислоты. Использование названного состава экстрагента позволяет минимизировать его расход, последующие трудо- и энергозатраты на выделение целевого продукта и потери его активных компонентов, что увеличивает выход целевого продукта. Пример 1. 8 кг зачищенных реберных костей свиней измельчают в стерильных условиях. К ним добавляют 3 л стерильной жидкой питательной среды описанного выше состава. Суспензию встряхивают на шейкере при 37  С в течение 1 часа для вымывания клеток костного мозга. Клетки отделяют фильтрацией и отмывают центрифугированием в той же питательной среде при 4С. Полученные клетки разбавляют той же средой, доводя их концентрацию до 1·109 клеток/дм3, и инкубируют в течение 18-20 часов при 37С. Далее отделяют супернатант центрифугированием при 5000 об/мин и температуре 4С. Супернатант пропускают через колонку, заполненную биоспецифическим сорбентом Адан. Адсорбированный материал экстрагируют при 6С, используя в качестве экстрагента 50-80% раствор этилового спирта в 0,1% водном растворе уксусной кислоты. При концентрации выше указанной экстракция не происходит. При концентрации ниже указанной резко увеличивается расход экстрагента, что при последующей лиофильной сушке препарата приводит к увеличению времени сушки и энергетических затрат, а также к снижению активности препарата. Выход продукта с коэффициентом стимуляции 1,8 колеблется от около 40000 доз препарата при граничных значениях концентрации экстрагента до 50000 при концентрации этилового спирта в экстрагенте 60% по объему.
Таким образом, при упрощенной технологии и сниженных трудозатратах предлагаемый способ позволяет увеличить выход Миелопида.
Пример 2.
Препарат готовят по примеру 1, но с использованием питательной среды, содержащей следующие компоненты, мг/дм3:
CaCl2 200
Fе(NО3)3·9Н2O 0,1
KCl 400
MgSO4·7H2O 200
NaCl 5400
NаНСО3 3700
NaH2PO4·H2O 124
Глюкоза 4600
Пируват натрия 110
Гептамицин 15
L-аргинин хлорид 84
L-цистидин 48
L-глутамин 780
Глицин 30
L-гистидин хлорид водный 42
L-изолейцин 105
L-лейцин 105
L-лизин хлорид 146
L-метионин 30
L-фенилаланин 86
L-серин 42
L-треонин 85
L-триптофан 18
L-тирозин 72
L-валин 94
Холин хлорид 4
Фолиевая кислота 4
i-инозитол 7,2
Никотинамид 4
Натриевая соль пантотеновой кислоты 4
Пиридоксал хлорид 4
Рибофлавин 0,4
Тиамин хлорид 4
Выход продукта с коэффициентом стимуляции 1,8 колеблется от 20000 до 32000 доз препарата при различной концентрации этилового спирта в экстрагенте.
Пример 3.
Препарат готовят по примеру 1, но с использованием питательной среды, содержащей следующие компоненты, мг/дм3:
Са(NО3)2·4Н2O 100
KCl 400
МgSO4·7Н2O 100
NaCl 6000
NaHCO3 2000
Na2HPO4 801
Глюкоза 2000
Глутатион 1
Гептамицин 15
L-аргинин хлорид 342
L-аспарагин 50
L-аспарагиновая кислота 20
L-цистидин 50
L-глутамин 500
L-глутаминовая кислота 20
Глицин 10
L-гистидин хлорид 18,2
L-гидроксипролин 20
L-изолейцин 50
L-лейцин 50
L-лизин хлорид 50
L-метионин 15
L-фенилаланин 15
L-пролин 20
L-серин 30
L-треонин 25
L-триптофан 5
L-тирозин 20
L-валин 20
р-аминобензойная кислота 1
Биотин 0,2
Холин хлорид 3
фолиевая кислота 1
i-инозитол 36
Никотинамид 1
Натриевая соль пантотеновой кислоты 0,75
Пиридоксал хлорид 1
Рибофлавин 0,2
Тиамин хлорид 1
Витамин B12 0,008
Выход продукта с коэффициентом стимуляции 1,8 колеблется от 12000 до 25000 доз препарата при различной концентрации этилового спирта в экстрагенте.
Формула изобретения 1. Способ получения Миелопида, включающий приготовление суспензии клеток костного мозга, их инкубирование в питательной среде, отделение супернатанта и последующее выделение из него целевого продукта, отличающийся тем, что для суспендирования и инкубирования клеток используют неокрашенную среду, а выделение целевого продукта осуществляют путем пропускания супернатанта через биоспецифический сорбент Адан и экстрагирования адсорбированного материала 50-80%-ным раствором этилового спирта в 0,1%-ном водном растворе уксусной кислоты. 2. Способ по п.1, отличающийся тем, что для суспендирования и инкубирования клеток костного мозга используют среду, содержащую следующие компоненты, мг/дм3: СаСl2 200 Fe(NO3)2·9H2O 0,1 КСl 400 MgSO4·7H2O 200 NaCl 6800 NaHCO3 2200 NaH2PO4·H2O 140 Аденин 10 Натриевая соль аденинтрифосфата 10 Адениновая кислота 0,2 Холестерол 0,2 2-Деоксирибоза 0,5 Глюкоза 1000 Глутатион 0,05 Гуанин хлорид 0,3 Гипоксантин 0,3 Рибоза 0,5 Ацетат натрия 50 Тимин 0,3 Твин 80 20 Урацил 0,3 Ксантин 0,3 DL-аланин 50 L-аргинин хлорид 70 DL-аспарагиновая кислота 50 L-цистеин хлорид 0,1 L-цистидин 20 L-глутамин 100 DL-глутаминовая кислота·Н2О 150 Глицин 50 L-гистидин хлорид 20 L-гидроксипролин 10 DL-изолейцин 40 DL-лейцин 120 L-лизин хлорид 70 DL-фенилаланин 50 DL-метионин 50 L-пролин 40 DL-серин 50 DL-треонин 60 DL-триптофан 20 L-тирозин 40 DL-валин 50 р-Аминобензойная кислота 0,05 Аскорбиновая кислота 0,05 Биотин 0,01 Кальциферол 0,1 Холин хлорид 0,5 Фолиевая кислота 0,01 i-Инозитол 0,05 Менадион 0,01 Никотинамид 0,025 Никотиновая кислота 0,025 Натриевая соль пантотеновой кислоты 0,01 Пиридоксаль хлорид 0,025 Пиридоксин хлорид 0,025 Рибофлавин 0,01 Тиамин хлорид 0,01 п-Токоферолфосфат натрия 0,01 Витамин А 0,1 |
||||||||||||||||||||||||||
