Патент на изобретение №2231553

(54) ШТАММ БАКТЕРИЙ MYCOBACTERIUM NEOAURUM И СПОСОБ ЕГО ИСПОЛЬЗОВАНИЯ ДЛЯ ПОЛУЧЕНИЯ АНДРОСТ-4-ЕН-3,17-ДИОНА ИЗ СТЕРИНОВ РАСТИТЕЛЬНОГО И ЖИВОТНОГО ПРОИСХОЖДЕНИЯ

(57) Реферат:

Штамм Mycobacterium neoaurum, депонированный в ВКПМ под номером ВКПИ Ac-1634, способен трансформировать стерины животного и растительного происхождения (холестерин и фитостерины) до андрост-4-ен-3,17-диона. Штамм обеспечивает получение целевого продукта без примеси стероидов с недоокисленной боковой цепью в концентрации до 7-12 г/л при нагрузке исходного стерина от 10 до 30 г/л соответственно. При этом штамм способен эффективно трансформировать фитостерины любого состава. 2 н.п. ф-лы, 1 табл.

Настоящее изобретение относится к области биотехнологии, а именно касается получения стероидных медицинских препаратов с использованием микроорганизмов.

Холестерин и различные фитостерины (полученные из сои, сахарного тростника, отходов целлюлозно-бумажной промышленности и др.) являются в настоящее время самым дешевым и доступным стероидным сырьем. Они могут быть превращены в андрост-4-ен-3,17-дион (АД), который является ключевым соединением в синтезе стероидных лекарственных препаратов, таких как метандростенолон, спиронолактон, ацетомепрегенол, гидрокортизон, преднизолон и др. [1].

Трансформация стеринов в АД осуществляется благодаря микробному расщеплению боковой цепи стеринов и описана в научной и патентной литературе [2-7].

Большинство известных способов получения АД из стеринов основано на использовании разных видов бактерий рода Mycobacterium. Микобактерии имеют преимущества по сравнению с другими микроорганизмами, поскольку при высокой окислительной активности способны эмульгировать углеводороды в водной среде, увеличивая тем самым их доступность для трансформации [3]. Для получения АД используют штаммы Mycobacterium fortuitum [8], Mycobacterium parafortuitum [9], Mycobacterium phlei [10], Mycobacterium smegmatis [II], Mycobacterium vaccae [12]. В качестве субстрата для получения АД с помощью этих штаммов используют, как правило, индивидуальные стерины: холестерин или -ситостерин. Однако для получения АД в промышленном масштабе выгоднее использовать в качестве субстрата не индивидуальные стерины, а фитостерины, представляющие собой смесь стеринов с различной длиной и строением боковой цепи и с различным строением колец А и В. Для штаммов, использующих индивидуальные стерины, показано, что их трансформирующая активность существенно зависит от строения стерина и уменьшается в следующем порядке: холестерин > кампестерин, -ситостерин > стигмастерин > эргостерин [3, 6, 13].

Целью изобретения в части штамма является получение нового мутантного штамма бактерий, способного эффективно трансформировать до АД стерины как растительного (фитостерины), так и животного (холестерин) происхождения. Для селекции штамма, окисляющего стерины животного и растительного происхождения, в качестве исходной родительской культуры использован штамм Mycobacterium sp. 97, выделенный с поверхности 10%-ной суспензии целлюлозного фитостерина, содержащей 3% ПАВ. Исходный штамм модифицирован с помощью мутагенных факторов (УФ-облучение) и селективных факторов (выращивание на твердых средах с холестерином, либо андростендионом в качестве единственного источника углерода).

Микроорганизм идентифицирован как Mycobacterium neoaurum на основании данных сиквенса рибосомальной 16S-PHK и культурально-морфологических признаков.

Морфологические и культуральные признаки микроорганизма -неподвижные, неспорообразующие клетки, в молодой культуре – короткие палочки 1,5-4,00,4-0,8 ммк, иногда слегка искривленные, в старой культуре – одиночные и собранные в группы кокки 0,8-1,0 ммк. Колонии на МПА, кукурузно-глюкозном агаре, агаре с соевой мукой неровно округлые, диаметром до 10 мм, слегка морщинистые, плоские с неровным краем, легко снимаются с поверхности агара, пигментированные. При инкубации в темноте – колонии бледно-желтые, на свету – апельсинового цвета. Пигмент (не идентифицированной природы) в среду не выделяется.

Физиолого-биохимические признаки – аэроб, не растет при 10 и 45С, оптимальная температура для роста 27-30С, – не растет на агаре Мак-Конки и в присутствии 0,01% малахитового зеленого. Твин 80 гидролизует. Использует в качестве источника углерода маннит, сорбит, глицерин, цитрат. Образует кислоты из фруктозы, глюкозы, глицерина, маннита. Из дульцита, ксилозы и арабинозы кислоты не образует. В качестве источника азота использует минеральные и органические формы азота. Не гидролизует целлюлозу, крахмал, не разжижает желатин, не разлагает казеин, использует мочевину, аммонийный и нитратный азот, растет в присутствии 0,5 мг/мл NH₂HCl.

Штамм Mycobacterium neoaurum депонирован во Всероссийской Коллекции Промышленных Микроорганизмов (ВКПМ) под номером ВКПМ Ас-1634.

Штамм не патогенен для теплокровных животных.

Штамм Mycobacterium neoaurum имеет низкую субстратную специфичность по отношению к стероидному субстрату, т.е. эффективно трансформирует смеси стеринов различного состава, такие как соевые стерины, фитостерины – отходы целлюлозной промышленности, в частности стерины таллового масла. Как видно из таблицы, соотношение идентифицированных индивидуальных стеринов в трансформируемом субстрате (фитостерин), анализируемых до и после ферментации, изменяется очень незначительно.

Целью изобретения в части способа является применение нового эффективного мутантного штамма бактерий Mycobacterium neoaurum ВКПМ Ас-1634 для трансформации стеринов растительного (фитостерины) и животного (холестерин) происхождения в андрост-4-ен-3,17-дион (АД) – ключевой промежуточный продукт в синтезе стероидных медицинских препаратов.

Штамм Mycobacterium neoaurum ВКПМ Ac-1634 способен эффективно трансформировать стерины растительного и животного происхождения при концентрации до 30 г/л с образованием целевого продукта андрост-4-ен-3,17-диона без примеси андроста-1,4-диен-3,17-диона.

Ближайшим аналогом заявляемому является способ получения АД из фитостеринов таллового масла или фитостеринов из рапсового масла (патент US 6071714) [14]. Согласно этому способу трансформацию стеринов в АД проводят в присутствии большого количества солюбилизирующих агентов, например в присутствии пропиленгликоля (0,8-1,0 л для 100 г фитостеринов). По окончании трансформации получают АД в смеси с АДД в соотношении от 9:1 до 7:3.

Недостатки способа:

– трансформация происходит с образованием побочного продукта АДД,

– трансформацию стеринов в АД проводят в присутствии большого количества солюбилизирующих агентов, например в присутствии пропиленгликоля (0,8-1,0 л для 100 г фитостеринов). Это приводит к усложнению технологии получения АД и его выделения.

Поставленная цель достигается тем, что трансформации холестерина и фитостеринов осуществляют с помощью культуры Mycobacterium neoaurum ВКПМ Ac-1634, которая селективно расщепляет боковую цепь стеринов при нагрузке 10-30 г/л с образованием АД без примеси стероидов с недоокисленной боковой цепью.

Приведенные ниже примеры показывают, что стероидтрансформирующая активность культуры Mycobacterium neoaurum ВКПМ Ac-1634 не уменьшается при изменении композиционного состава фитостеринов. Конверсия составляет 93-98%. Оценка проведена с помощью ВЭЖХ-анализа.

Пример 1.

Mycobacterium neoaurum ВКПМ Ac-1634 выращивают в течение 7-10 суток на твердой среде следующего состава (г/л): глюкоза – 10, соевая мука – 3,0, лимонная кислота – 2,2, мочевина – 0,5, аммоний хлористый – 1,0, калий фосфорнокислый однозамещенный – 0,5, магний сернокислый – 0,5, кальций углекислый – 1,5, железо сернокислое – 0,05, агар-агар – 2,5, рН 7,0-7,5. Биомассу переносят в жидкую среду того же состава (без агара), в которой культуру выращивают в течение 48-70 ч в аэробных условиях на качалке при температуре 30С (питательную среду разливают по 100 мл в конические колбы объемом 750 мл). Полученный посевной материал в количестве 10 об. % переносят в среду для трансформации следующего состава (г/л): глюкоза – 10, соевая мука – 10, лимонная кислота – 2,2, мочевина – 0,5, аммоний фосфорнокислый двухзамещенный – 1,5, магний сернокислый – 0,5, кальций углекислый – 1,5, железо сернокислое – 0,05, измельченный фитостерин (размер частиц 3-10 мк) – 10, сорбиталь – 3,2, рН 6,8-7,2. Среду для трансформации разливают по 50 мл в колбы Эрленмейера объемом 500 мл. Трансформацию проводят в аэробных условиях на качалке при температуре 30С в течение 85-100 ч. Получают продукт с выходом 66,2% (от теор.) с содержанием основного вещества 97%, т.пл. 168-170С.

Пример 2.

Посевной материал, полученный аналогично примеру 1 (1-й инокулят), вносят в 500 мл свежей питательной среды того же состава, как для 1-ого инокулята, инкубируют на качалке в условиях примера 1 в течение 24 ч и получают 2-й инокулят, который переносят в ферментер объемом 10 л, заполненный 5 л трансформационной среды состава, приведенного в примере 1, но с добавлением пеногасителя. Трансформацию проводят в течение 4 суток при 30С, перемешивании 700 об/мин и подаче воздуха с интенсивностью до 0,6 л/л среды/мин.

Пример 3.

Проводят трансформацию аналогично примеру 1, но с заменой фитостерина на холестерин. По окончании ферментации концентрация АД составляет 7,0 г/л.

Пример 4.

Трансформацию холестерина при нагрузке 30 г/л проводят в условиях примера 1 в течение 330 ч. Выделяют продукт с выходом 52,6% (от теор.) и содержанием основного вещества 96%.

Цитируемые источники

1. Машковский М.Д. “Лекарственные средства”. М.: Медицина, 1993, т.1, с.690-710; т.2, с.541-551.

2. Хим. – фарм. журнал, 1987, т.21, с.1469-1471.

3. Ахрем А.А., Титов Ю.А. Стероиды и микроорганизмы. М.: Наука.

4. Пат. Японии 79.89087, Кл. С 12 Р 13/00, Chem. Abstr. Vol. 91, ref. 156042.

5. ЕР 0274147, Кл. С 12 Р 33/00. 03.12.86 NL, №8603083.

6. ЕР 0008214, Кл. С 12 Р 33/16, Chem. Abstr. Vol. 93, ref. 6154. Uovcha M.G., Brooks K.E.

7. Пат. Японии 83. 43796, Кл. С 12 Р 33/16, Chem. Abstr. Vol. 99, ref. 103708.

8. Пат. США 4345033, Кл. 435-55, 17.08.82.

9. Пат. Японии 80.00010, Chem. Abstr vol. 92, ref. 162196. Imata Y., Takahashi K.

10. Пат. ГДР 137840, С 07 J 13/00, Chem. Abstr. Vol. 92, ref. 196379. Hoerhold С., Boehme K.H., Wetzker M., Schubert K.

11. Пат. ГДР 137361, С 07 J 1/00. Заявлено 26.06.78. Опубл. 29.08.79. Hoerhold С., Komel R., Groh H.

12. Пат. ГДР 248143, С 12 Р 33/02. Опубл. 29.07.87. Hoerhold C., Gottschaldt В., Boehme K.H., Deppmeyer H. et al.

13. Nagasava M., et al. Agr. & Biol. Chem. V.34. P. 798-890. Cem. Abstr. Vol 73, ref. 22487 у.

14. Пат. США 6071714, С 12 Р 33/00. Kutney J.P., Milanova R.K. et al.

Формула изобретения

1. Штамм бактерий Mycobacterium neoaurum ВКПМ Ас-1634, способный трансформировать стерины растительного и животного происхождения до андрост-4-ен-3,17-диона.

2. Способ получения андрост-4-ен-3,17-диона из стеринов растительного и животного происхождения путем микробиологической трансформации, отличающийся тем, что в качестве микроорганизма-трансформатора используют штамм Mycobacterium neoaurum ВКПМ Ас-1634.