Патент на изобретение №2228954

(54) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ПОТЕРЬ АКТИВНОСТИ ФЕРМЕНТА ПРИ ТЕПЛОВОМ ОБЕЗВОЖИВАНИИ ФЕРМЕНТНЫХ РАСТВОРОВ

(57) Реферат:

Изобретение относится к биотехнологии и представляет собой способ определения потерь активности ферментов при тепловом обезвоживании ферментных растворов. Способ определения потерь активности ферментов при тепловом обезвоживании ферментных растворов заключается в том, что раствор ферментного препарата различных концентраций и раствора для имитации процесса наносят на металлическую сетку с разными размерами ячеек и высушивают в регулируемых условиях, моделирующих процесс обезвоживания. Изобретение обеспечивает подбор оптимальных параметров процесса теплового обезвоживания, стабилизаторов и уменьшение расхода ферментного препарата (25,0-50,0 мл раствора) при обезвоживании ферментных растворов. 1 табл.

Изобретение относится к микробиологической промышленности, биотехнологии, в частности к способам получения обезвоженных ферментных препаратов, и может быть использовано в медицинской, микробиологической промышленности и биотехнологии.

Известно, что с помощью теплового обезвоживания обрабатывают большие массы ферментных растворов и получают измельченный сухой препарат. Сохранение активности фермента при тепловом обезвоживании [Грачева И.М. Технология ферментных препаратов. М., ВО Агропромиздат, 1987, с.144-147] зависит от источника получения ферментного препарата, рН раствора ферментного препарата, концентрации сухих веществ и стабилизаторов или наполнителей в высушиваемой жидкости, длительности пребывания препарата в сушильной башне и температуры теплоносителя. Определение оптимальных условий и режимов сушки ферментных растворов производится опытном путем для каждого конкретного ферментного препарата в сушильном аппарате.

Основным недостатком определения оптимальных условий и режимов при обезвоживании раствора ферментного препарата является то, что в процессе обезвоживания используются сушильные аппараты, предусматривающие большой расход раствора ферментных препаратов.

Технический результат настоящего изобретения состоит в разработке способа определения потерь активности фермента при тепловом обезвоживании ферментных растворов для получения оптимальных параметров процесса теплового обезвоживания, подбора стабилизаторов и уменьшении расхода ферментного препарата (25,0-50,0 мл раствора).

Сущность предлагаемого способа заключается в следующем.

Способ определения потерь активности фермента при тепловом обезвоживании предусматривает имитацию процесса обезвоживания: ферментные растворы или растворы обезвоживаемых веществ, нанесенных на проволочную сетку из нержавеющего металла (например, нержавеющей стали, латуни) с различными размерами ячейки сетки от 0,3 мм до 1,0 мм, дающие разные соотношения массы раствора к площади поверхности испарения, приводят в контакт с высушивающим агентом в рабочей камере электрических печей с различной температурой высушивающего агента и различным временем контакта раствора. Далее сравнивая активность фермента на сетке в растворе до сушки и в высушенном препарате, определяют потери активности фермента при тепловом обезвоживании и по результатам изменения активности осуществляют подбор оптимальных условий теплового обезвоживания ферментных растворов.

Для определения точности набора объема раствора сетками с различными ячейками опыт проводят с карбонатом натрия Na₂CO₃, не подвергающегося в процессе обезвоживания количественным изменениям. Для определения содержания в растворе карбоната натрия Na₂CO₃ используют методику титрования карбоната натрия стандартным раствором хлористоводородной кислоты. Сетки из нержавеющей стали размером ячейки D=1,0 мм и латуни размером ячейки D=0,315 мм погружают в раствор Na₂O₃ с титром, определенным титрованием стандартным раствором хлористоводородной кислоты. Далее с сеток с нанесенным раствором в горизонтальном положении снимают избыток жидкости фильтровальной бумагой по краям проволочной рамки из нержавеющей проволоки с диаметром проволоки D=1,0 мм и высушивают в муфельной печи при температуре 150 в течение 3 минут. После этого высушенный карбонат натрия с сетки растворяют в 25 мл дистилированной воды в прямоугольных ячейках размером 100х25х10 мм и определяют количество Nа₂СО₃ перенесенного сеткой титрованием стандартным раствором хлористоводородной кислоты. Одновременно с опытным определением проводят контрольное определение количества Na₂CO₃ перенесенного сеткой на той же сетке, исключая процесс сушки. После проведения статистической обработки результатов 10 опытов установили, что количество вещества переносимого сетками раствора соответствуют как в контрольном, так и опытном варианте. Объем раствора удерживаемого сеткой составляет для сетки с размером ячейки 1,0 мм 0,2878±0,005 мл или 0,2878±1,8%, аналогично для сетки с размером ячейки 0,315 мм 0,2228±0,006 мл или 0,2228=2,7%.

Пример 1

В раствор фермента целлюлаз, полученный путем очистки фильтрата культуральной жидкости продуцента целлюлаз гриба Trichoderma viride методами микро – и ультрафильтрации с активностью по фильтровальной бумаге 11,0 ед/мл (метод Мандельс-Вебера) опускают сетки из нержавеющей стали размером ячейки D=1,0 мм и латуни размером ячейки D=0,315 мм. Далее с сеток с нанесенным раствором в горизонтальном положении снимают избыток жидкости фильтровальной бумагой по краям проволочной рамки из нержавеющей проволоки с диаметром проволоки D=1,0 мм и высушивают в муфельной печи при температуре 150 в течение 3 минут. После этого высушенный ферментный препарат с сетки растворяют в 25 мл дистилированной воды в прямоугольных ячейках размером 100х25х10 мм и определяют активность ферментного препарата.

Одновременно с опытным определением проводят контрольное определение активности ферментного препарата на той же сетке, исключая процесс сушки. Разница активности ферментного препарата контрольной и опытной проб показывает степень инактивации ферментного препарата в процессе обезвоживания. Сравнивая активность фермента на сетке в растворе до сушки и в высушенном препарате после сушки, определяют потери активности при тепловом обезвоживании. Результаты эксперимента приведены в строке 1 таблицы.

Пример 2

Эксперимент проводят аналогично примеру 1, но вместо раствора фермента целлюлаз с активностью по фильтровальной бумаге 11,0 ед/мл (метод Мандельс-Вебера) используют раствор фермента целлюлаз с активностью 20,0 ед/мл по фильтровальной бумаге. Результаты эксперимента приведены в строке 2 таблицы.

Пример 3

Эксперимент проводят аналогично примеру 1, но вместо высушивания в муфельной печи при температуре 150С в течение 3 минут высушивают при температуре 60С в течение 10 минут. Результаты эксперимента приведены в строке 3 таблицы.

Пример 4

Эксперимент проводят аналогично примеру 1, но в раствор фермента вносят дополнительно сульфат аммония (NH₄)₂SO₄ в количестве 1,0 мг/мл. Результаты эксперимента приведены в строке 4 таблицы.

Пример 5

Эксперимент проводят аналогично примеру 1, но в раствор фермента вносят дополнительно сульфат аммония (NH₄)₂SO₄ в количестве 50,0 мг/мл. Результаты эксперимента приведены в строке 5 таблицы.

Пример 6

Эксперимент проводят аналогично примеру 1, но в раствор фермента вносят дополнительно карбоксиметилцеллюлозу (КМ-целлюлоза) в количестве 1,0 мг/мл. Результаты эксперимента приведены в строке 6 таблицы.

Пример 7

Эксперимент проводят аналогично примеру 1, но вместо раствора фермента целлюлаз используют раствор фермента пектиназ, полученный путем очистки фильтрата культуральной жидкости продуцента пектиназ гриба Aspergillus foetidus методами микро – и ультрафильтрации с пектолитической активностью при каталитическом расщеплении пектина ед/мл (интерферометрический метод). Одновременно с опытным определением проводят контрольное определение активности ферментного препарата на той же сетке, исключая процесс сушки. Разница активности ферментного препарата контрольной и опытной проб показывает степень инактивации ферментного препарата в процессе обезвоживания. Сравнивая активность фермента на сетке в растворе до сушки и в высушенном препарате после сушки, определяют потери активности при тепловом обезвоживании. Результаты эксперимента приведены в строке 7 таблицы.

Таким образом, с использованием предлагаемой методики для растворов ферментов возможно подобрать эффективные стабилизаторы, предохраняющие ферменты от инактивации в процессе обезвоживания при действии высоких температур и получения препаратов ферментов со стабилизацией в процессе сушки. Данный способ дает возможность уменьшения потерь ферментативной активности на одной из основных стадий процесса получения препарата ферментов, соответственно удешевления получаемого продукта за счет получения дополнительного продукта, уменьшения объема и исключения из процесса некоторых материалов.

Данная методика позволяет работать с небольшими количествами термолабильных ферментных препаратов и биологически активных веществ, может применяться для получения оптимальных параметров процесса теплового обезвоживания растворов ферментных препаратов, выбора способа обезвоживания и стабилизаторов, способствующих уменьшению потерь ферментативной активности при тепловом обезвоживании с применением различных температур процесса, времени процесса и различными соотношениями массы раствора к площади поверхности испарения, для процесса сушки распылением.

Формула изобретения

Способ определения потерь активности фермента при тепловом обезвоживании ферментных растворов, заключающийся в имитации процесса теплового обезвоживания ферментных растворов путем нанесения ферментного раствора на проволочную сетку из нержавеющего металла с размером ячейки D = 1,0 мм или D = 0,315 мм, высушивании при различных температурных значениях высушиваемого агента и продолжительности сушки, определении активности фермента на сетке в растворе до сушки и в высушенном препарате, а по результатам изменения активности ферментного препарата определяют потери активности при тепловом обезвоживании.