Патент на изобретение №2227298
|
||||||||||||||||||||||||||
(54) СПОСОБ ПОЛУКОЛИЧЕСТВЕННОЙ ОЦЕНКИ ИЗМЕНЕНИЙ В БИОПТАТАХ ПЕЧЕНИ ПРИ ХРОНИЧЕСКИХ ВИРУСНЫХ ГЕПАТИТАХ
(57) Реферат: Изобретение относится к области медицины, в частности гепатологии. Способ полуколичественной оценки изменений в биоптатах печени при хронических вирусных гепатитах приводит к протоколу подсчета в баллах патологических признаков, выявленных при морфологическом изучении биоптатов печени больных хроническими вирусными гепатитами, по разделам: внутридольковая дегенерация и фокальные некрозы (до 4 баллов), перипортальные ступенчатые и мостовидные некрозы (до 10 баллов), портальное воспаление (до 4 баллов), отдельный учет фиброза/цирроза (до 4 баллов). При этом в протокол дополнительно включена оценка состояния внутрипеченочных желчных протоков, иммуногистохимическое выявление антигенов этиологических вирусных агентов гепатитов, альфа-гладкомышечного актина, ядерного антигена пролиферирующих клеток, холангиолярных цитокератинов (№7 и 19), HLA-DR клеток и клеток-естественных киллеров. Способ позволяет установить количественную унификацию полученных результатов при указанных заболеванях. 1 табл. Изобретение относится к области медицины, в частности гепатологии. Известен способ ранговой оценки степени выраженности воспаления, некроза и фиброза, разработанный Knodell et al. в 1981 году [1]. Этот полуколичественный метод заключается в балльной оценке гистологических изменений в биоптатах печени по разделам: перипортальные и мостовидные некрозы (до 10 баллов),внутридольковая дегенерация и фокальные некрозы (до 4 баллов), портальное воспаление (до 4 баллов) и фиброз (до 4 баллов).Данный метод известен как “индекс Knodell” и наиболее широко распространен в Российской Федерации. Недостатком данного метода является объединение оценки активности некро-воспалительных реакций и фибротических (цирротических) изменений, хотя последние являются следствием первых и не отражают активность воспаления. Фиброзные изменения в большей степени стабильны и характеризуют стадию изменения гистоархитектоники печеночной дольки или ацинуса. Именно в силу достаточной стабильности соединительнотканных образований полуколичественная оценка, предложенная Knodell, не позволяет проследить динамику воспалительных процессов. Известна также система оценки активности и стадии развития гепатитов по алгоритму, предложенному Scheuer [2]. В данном ранговом протоколе оценивают некрозы и воспалительные изменения в диапазоне от 0 до 4 баллов с раздельным подсчетом порто-перипортального компонента и ацинарных изменений. Архитектурные изменения гистологического строения печени вследствие фиброза также оцениваются отдельно в 4-балльном диапазоне. Недостатком данной системы подсчета является потеря количественной унификации получаемых результатов с широко применяемым индексом Knodell, а также снижение чувствительности оценки выявленных изменений. Наиболее близким, принятым за прототип, является протокол ранговой оценки повреждения печени, разработанный V.Desmet и соавторами из Католического университета Леувена (Бельгия). От других предложенных методов она отличается тем, что авторы раздельно оценивают ступенчатые и мостовидные некрозы, соблюдается важный принцип – унификация балльной оценки. Максимальное количество баллов при оценке некрозов и воспаления, как и в индексе Knodell, равно 18 [3]. Особым же достоинством системы является удобный и понятный метод оценки стадий заболевания (хронический гепатит с минимальной активностью, слабовыраженный, умеренный, тяжелый хронические гепатиты). В данной системе, как и в вышеуказанных, не используются дополнительные, прежде всего иммуногистохимические методы, исследований, которые позволяют установить этиологию и прогнозировать течение заболевания. В связи с этим определение этиологии и прогностическая оценка патологических процессов в печени остаются недоступными. Предлагаемый нами метод полуколичественной оценки морфологических и иммуногистохимических изменений в биоптатах печени при хронических вирусных гепатитах позволяет установить этиологию, степень активности и стадию заболевания, прогнозировать течение гепатита, выявлять механизмы повреждения и контролировать эффективность терапии. Новые возможности достигаются использованием иммуногистохимического окрашивания с антителами против антигенов вирусов гепатита В (HbsAg, HbcAg) и С (NS-3Ag), с антителами против ядерного антигена пролиферирующих клеток – (PCNA), иммуногистохимическое выявлением альфа-гладкомышечного актина (  -SMA), “холангиолярных” цитокератинов (№7 и №19), учетом степени выраженности иммунных реакций (HLA-DR) и активации NK-клеток, оценкой повреждения, пролиферации желчных протоков, наличия дуктопении.
Протокол ранговой оценки изменений в биоптатах печени при хронических вирусных гепатитах
1. Внутридольковая дегенерация и фокальные некрозы Баллы
А. Нет 0
Б. Слабая 1
(ацидофильные тельцы, баллонная дегенерация и/или отдельные фокусы некрозов в <1/3 долек)
В. Умеренная (как “Б” в 1/3-2/3 долек) 3
Г. Выраженная (как “Б” >2/3 долек) 4
2. Перипортальные ступенчатые и мостовидные некрозы
А. Нет 0
Б. Один или несколько “языков”
ступенчатых некрозов в
отдельном ПТ
(ПТ – это портальный тракт) 1
В. Как “Б” >1 ПТ 2
Г. Ступенчатые некрозы занимают
<50% большинства ПТ 3
Д. Ступенчатые некрозы занимают
>50% большинства ПТ 4
Е. Как “Д” + септальный некроз 5
Ж. Порто-портальный
мостовидный некроз 6
Порто-центральный
мостовидный некроз 8
И. Панлобулярный (сливной) некроз 10
3. Портальное воспаление
А. Нет 0
Б. Слабое (отдельные клетки
воспаления в <1/3 ПТ) 1
В. Как “Б” >1/3 ПТ 2
Г. Умеренное (много воспалительных
клеток в 1/3-2/3 ПТ) 3
Д. Выраженное (плотные
воспалительные инфильтраты в
>2/3 ПТ) 4
Сумма баллов —
Повреждение желчных протоков есть/нет
Пролиферация протоков есть/нет
Дуктопения есть/нет
Иммуногистохимия
1. HbsAg есть/нет цитоплазма/мембраны гепатоцитов
2. HbcAg есть/нет ядро/цитоплазма/мембраны гепатоцитов
3. HCV есть/нет
4. alpha-SMA сосуды/перипортальные клетки/синусоидные клетки
5. PCNA А. В гепатоцитах (0-1%, 1-10%, 10-30%, >30%)
Б. Клетки воспаления есть/нет
В. Синусоидные клетки есть/нет
Цитокератины №7/19 в
гепатоцитах есть/нет
7. HLA-DR клетки воспаления/синусоидные клетки/холангиоциты/гепатоциты
8. NK клетки (среднее кол-во) в ПТ, в ацинусе
Оценивая степень активности в зависимости от количества баллов, может быть поставлен следующий морфологический диагноз:
а) от 1 до 3 – хронический гепатит с минимальной активностью процесса;
б) от 4 до 8 – слабовыраженный хронический гепатит;
в) от 9 до 12 – умеренный хронический гепатит;
г) от 13 до 18 – тяжелый хронический гепатит.
Фиброз/Цирроз
А. Нет 0
Б. Слабовыраженный (Перипортальный) 1
В. Умеренный (Порто-портальные септы
(1 и более)) 2
Г. Тяжелый (Порто-центральные септы
(1 и более)) 3
Д. Цирроз 4
Предлагаемый способ полуколичественной оценки изменений в биоптатах печени представляет собой унифицированную балльную систему. Максимальное количество баллов для оценки некрозов и воспаления – 18, то есть та же сумма, что у Knodell и Sciot&Desmet. Стадия заболевания оценивается в общепринятом четырехбалльном диапазоне. Кроме того, для определения этиологии вирусного гепатита обязательно используется окрашивание с антителами против антигенов вирусов гепатита В и С. А для гепатита В определяется фаза заболевания. Различный паттерн окраски с антителами против HBsAg и HBcAg позволяет определить репликативную, элиминативную (низкий уровень репликации) и интегративную фазы. Верификация фазы хронического гепатита В помогает определить необходимость назначения интерферонов. В случае интегративной фазы нет показаний для интерферонотерапии. Критерии иммуногистохимического определения фазы вирусного гепатита представлены в таблице.
Для определения степени выраженности альтерации, напряженности регенераторного ответа и возможной узловой трансформации оценивается пролиферативная активность различных клеточных типов печени (иммуногистохимическое окрашивание с антителами против ядерного антигена пролиферирующих клеток – PCNA). Прогностически важным является и иммуногистохимическое выявление альфа-гладкомышечного актина (-SMA). Именно этот белок появляется в цитоплазме синусоидных клеток Ито, когда они трансдифференцируются в миофибробласты. Последнее является ключевым событием начала синтеза коллагенов и развития фиброза и выявляется до момента морфологически видимых изменений в виде отложения фибриллярных белков в зоне некроза и воспаления. Кроме того, иммуногистохимически оценивается степень выраженности иммунных реакций (HLA-DR) и активация NK-клеток, что очень важно в случае вирусного повреждения печени. Иммуногистохимическое выявление “холангиолярных” цитокератинов (№7 и №19) является наилучши критерием оценки состояния желчных протоков.
Эффективность предлагаемого метода определяется качеством и достоверностью диагностических критериев, которые соответствуют современным мировым стандартам морфологической диагностики хронических гепатитов. Если первая часть протокола, где оценивается степень активности и стадия заболевания, может быть проанализирована и заполнена на основании стандартных методов окраски, то состояние желчных протоков, экспрессию вирусных антигенов, регенераторный ответ печени, участие иммунного компонента в альтерации и прогноз фиброза не могут быть проанализированы без иммуногистохимии.
Метод полуколичественной оценки морфологически и иммуногистохимически выявленных изменений в биоптатах печени апробирован на 214 случаях хронических вирусных гепатитов. 132 пациента имели хронический гепатит С (ХГС), 82 – хронический вирусный гепатит В (ХГВ). Диагноз верифицировался с помощью традиционного комплекса клинических, эпидемиологических, биохимических и серологических критериев с обязательным подтверждением в полимеразной цепной реакции на ДНК вируса гепатита В и РНК вируса гепатита С.
В результате применения описанного метода удалось подтвердить этиологию заболевания в 100% случаев ХГВ иммуногистохимическим обнаружением HbsAg и/или HbcorAg в гепатоцитах.
Этиология ХГС подтверждалась обнаружением типичных морфологических признаков этого заболевания: выраженности жировой дистрофии гепатоцитов в сочетании с умеренным перипортальным и интралобулярным некрозом (1 и 2 зоны ацинуса), поражением желчных протоков.
В 43% рутинный гистологический анализ не позволял выявить изменения со стороны внутрипеченочных желчных протоков и только включение в протокол обследования методов иммуногистохимии (цитокератины №7 и №19) позволило визуализировать желчные протоки даже мелких портальных трактов. В 21 случае диагноз ХГС подтвержден обнаружением NS-3 антигена вируса гепатита С.
Уникальной возможностью метода является достоверное определение фазы естественного течения заболевания: вирусной репликации, элиминации (низкой репликации) и интеграции. Во всех 76 случаях обнаружения HbsAg и HbcorAg (100%) у больных ХГВ фаза была определена. У 54 пациентов – фаза репликации (HbcorAg – в ядре, HbsAg -слабая позитивность), у 7 – фаза элиминации (HbcorAg – в ядре или цитоплазме, HbsAg – выраженная цитоплазматическая и мембранозная позитивность), у 15 – фаза интеграции (HbcorAg – негативен, HbsAg – строгая цитоплазматическая позитивность).
Ценную информацию позволяет получить метод полуколичественной оценки морфологических и иммуногистохимических изменений в печени для определения степени активности гепатита. Во всех случаях, когда нам удавалось получить биоптат, включающий три портальных тракта и более (202 случая – 94,4%), вычислялся суммарный гистологический индекс активности гепатита.
У больных ХГВ гистологический индекс активности (HAI) в 73% случаев соответствовал степени повышения аланиновой аминотрансферразы (АлАТ) -традиционного биохимического индикатора активности воспаления; в 19% (15 чел.) наблюдений – HAI был повышен в большей степени, чем АлАТ, и у 7 (8,7%) больных градиент АлАТ превышал морфологическую оценку активности.
При ХГС соответствие между HAI и АлАТ наблюдалось в 64% (84 чел.) обследований, в остальных случаях HAI был более информативен, чем АлАТ.
Иммуногистохимическое выявление HLA-DR и NK дало возможность оценить общее количество и локализацию иммунокомпетентных клеток в пределах портальных трактов и разных зонах ацинуса, таким образом – выраженность иммунного и аутоиммунного (в случае экспрессии HLA-DR в гепатоцитах) компонентов воспалительной активности.
Следовательно, с помощью апробируемого метода нам удалось получить более точную и специфичную диагностическую информацию о степени активности воспалительного процесса в печени.
Для определения стадии развития заболевания морфологическая диагностика является незаменимой, т.к. позволяет прямо, а не по косвенным клинико-лабораторным признакам регистрировать степень фиброза и цирроз. Так, среди курируемых нами пациентов у 2 больных ХГВ и 3 – ХГС был обнаружен цирроз печени. Причем в двух случаях цирроз оказался диагностической находкой, т.к. не сопровождался убедительной клинической симптоматикой.
Использование -SMA как маркера гладкомышечной трансдифференцировки клеток Ито и как иммуногистохимического предвестника фиброзообразования, при отсутствии его морфологических признаков или их малой выраженности, позволило выделить группу риска (23 больных ХГВ, 36 больных ХГС) по развитию фиброза и цирроза, которая требует особого терапевтического внимания.
Лечение хронических вирусных гепатитов осуществляется дорогостоящими препаратами -интерферона и аналогами нуклеозидов с достаточно высокой частотой побочных реакций и негарантированной эффективностью. Поэтому особое значение имеет возможность контроля за эффективностью лечения не только с помощью молекулярно-генетических и серологических критериев, но и морфологических и иммуногистохимических методов. В частности, среди 7 обследованных нами нереспондентов интерферонотерапии (3-ХГВ, 4-ХГС), у 3 обнаружена положительная гистологическая динамика (более 2 пунктов НАI).
Таким образом, способ полуколичественной оценки морфологических и иммуногистохимических изменений в биоптатах печени при хронических вирусных гепатитах, сохраняя принятую в мировой практике систему 18-балльной оценки выявленных нарушений, позволяет выставить и сформулировать диагноз заболевания в полном соответствии с требованиями международной классификации хронических гепатитов (Лос-Анджелес, 1994 г.) с указанием этиологии, фазы, степени активности, стадии развития патологического процесса, а также контролировать эффективность проводимой терапии и, в ряде случаев, прогнозировать риск неблагоприятного течения заболевания.
Источники информации
Формула изобретения Способ полуколичественной оценки изменений в биоптатах печени при хронических вирусных гепатитах путем подсчета в баллах патологических признаков, отличающийся тем, что определяют признаки по разделам: внутридольковая дегенерация и фокальные некрозы; перипортальный ступенчатый и мостовидный некроз; портальное воспаление; отдельный учет фиброза/цирроза, а также в протокол включают оценку состояния внутрипеченочных желчных протоков, иммуногистохимическое выявление антигенов этиологических вирусных агентов гепатитов, оценку альфа-гладкомышечного актина, оценку ядерного антигена пролиферирующих клеток, холангиолярных цитокератинов (№7 и 19), HLA-DR клеток и клеток-естественных киллеров, по полученным морфологическим данным проводят расчет баллов с помощью предложенного протокола, на основании результатов балльной оценки изменений в биоптатах печени при значениях от 1 до 3 баллов определяют хронический гепатит с минимальной активностью, при значениях от 4 до 8 баллов – слабовыраженный хронический гепатит, от 9 до 12 – умеренный хронический гепатит, от 13 до 18 – тяжелый хронический гепатит. MM4A Досрочное прекращение действия патента Российской Федерации на изобретение из-за неуплаты в установленный срок пошлины за поддержание патента в силе
Дата прекращения действия патента: 25.06.2004
Извещение опубликовано: 20.05.2006 БИ: 14/2006
|
||||||||||||||||||||||||||
