Патент на изобретение №2227293

(54) СПОСОБ ОЦЕНКИ ТОКСИЧНОСТИ КОКЛЮШНЫХ ВАКЦИН

(57) Реферат:

Изобретение относится к области медицины, а точнее к области микробиологии и вакцинопрофилактики и касается оценки токсичности коклюшных вакцин. Способ осуществляется путем иммунизации экспериментальных животных коклюшной вакциной, предварительно обработанной низкочастотным ультразвуком (40-50 кГц), через сутки мышей декапитируют, в мозговой ткани определяют количество гистамина и при обнаружении его от 22,4 мкг/г и выше судят о выраженности токсического действия коклюшных вакцин. Преимущество изобретения заключается в упрощении способа и сокращении сроков. 2 табл.

Изобретение относится к области здравоохранения, а точнее к микробиологии и вакцинопрофилактике и может быть использовано для оценки токсичности коклюшных коммерческих вакцин, выпускаемых в серийное производство.

Анализ данных по осложнениям у детей, вызванным вакцинными препаратами, показал, что на первом месте по количеству и тяжести осложнений стоит адсорбированная коклюшно-дифтерийно-столбнячная вакцина (АКДС), в которой основным фактором, обуславливающим ее отрицательную характеристику, является коклюшный компонент (Marshall L. Неудачи программы вакцинации. Int. Health. Med., 1983, 21-23; Hodder Sh., Mortimer E. Эпидемиология коклюша и реакции на коклюшную вакцину. /Epidemiol. Rev., 1992, 14:243-287; Prins G., Spellman P. Коклюш. / Русс. мед. жур., 1995, т.1, №2, май). Тяжелейшие осложнения, индуцированные коклюшной корпускулярной вакциной, послужили основанием для отказа от прививок от коклюша в таких странах, как Япония, Англия, Швеция и др. (Stetler H. е.а. Польза, риск от вакцинации и судебные органы. /J.Pediatr., 1985, т.227, №692, с.1289), но это повлекло за собой массовые вспышки коклюшной инфекции у непривитых детей с большим процентом тяжелых форм, вплоть до смертельных исходов (Смерть от коклюша. – PPZS – центр по надзору за инфекционными болезнями”. Brit. Med. J. 1983, т.286, №372, с.1208 и др.).

Таким образом, применение коклюшной вакцины может повлечь за собой тяжелые поствакцинальные осложнения самого широкого спектра вплоть до энцефалопатий и энцефаломиелитов, а отказ от вакцинации – возможность заболевания коклюшем с поражением жизненно важных функций организма вплоть до летальных исходов.

Для устранения сложившейся ситуации наряду с разработкой вакцин с пониженным побочным действием, очевидна актуальность поиска информативных методов оценки критериев безвредности коклюшных вакцинных препаратов, выпускаемых в серийное производство.

Одним из серьезнейших проявлений реактогенности коклюшной инфекции являются осложнения со стороны нервной системы, такие как: энцефаломиели-ты, энцефалопатии, энцефаломиелинорадикулиты, миелиты и др., в основе которых лежит повреждение функциональных структур нервной ткани (нарушение проницаемости гематоэнцефалитического барьера, деструкция миелиновых волокон коры больших полушарий) (Канчурин А.Х., Гервазиева В.Б. К вопросу о патогенезе поствакцинальных коклюшных осложнений. В сб. “Иммунология нервных и психических заболеваний”. – М., 1975, с.276-280; Брагинская В.П. Вакцинальные неврологические осложнения у детей. /Невропатол. и психиатр., 1990; Prins G., Spellman P. Коклюш. /Русс. мед. жур., 1995, т.1, №2, май и др.).

Проведенными исследованиями по научно-медицинской и патентной литературе выявлен ряд способов определения повреждающего действия коклюшных вакцин на нервную систему организма. Так, А.А.Бабахин в статье “Блан-сттрансформация лимфоцитов периферической крови при коклюшном экспериментальном аллергическом энцефалите (АЭА)” (В сб. “Иммунология нервных и психических заболеваний”. – М., 1974, с.276-280) описывает способ оценки токсического действия коклюшных препаратов на нервную систему методом бласттрансформации лимфоцитов периферической крови морских свинок, иммунизированных коклюшными вакцинами, где в качестве митогена используется мозговой антиген. В журнале “Пат. физиол. и экпер. терапия” (1972, №4, с.36-40) А.Х.Канчурин и В.Б.Гервазиева излагают метод цитотоксического действия сенсибилизированных лимфоцитов от животных, привитых коклюшными антигенами, на клеточные культуры нервной ткани. М.М.Зотова предлагает использовать для оценки токсичности коклюшных препаратов цитотоксическое действие сывороток и их гамма-глобулиновых фракций при коклюшном ЭАЭ, выявляемое с помощью миграции макрофагов (В сб. “Иммунология нервных и психических заболеваний”. – М., 1974, с.298-299). Но вышеизложенные способы не дают полной информации о характере повреждающего действия коклюшных препаратов, отличаются высокой вариабельностью, кропотливостью исследований и использованием дорогостоящих реактивов.

Прототипом данного изобретения является метод, изложенный в патенте РФ №2174229 (Москаленко Е.П., Ильина С.И., Уразовский С.Ф. “Способ оценки токсичности коклюшных вакцин”, БИПМ №27, 2001 г.). Способ заключается в том, что мышам внутрибрюшинно вводят коклюшную вакцину, предварительно обработанную низкочастотным ультразвуком (42-50 кГц), в течение 5 минут. Через 7 дней мышей декапитируют в соответствии с “Правилами проведения экспериментальных работ на лабораторных животных” и забирают мозговую ткань. Кусочки мозга фиксируют в 2% растворе четырехокиси осмия (рН 7,3) для проведения дегидратации. Затем ткани заключают в смесь эпона с аралдитом. Ультраструктурные срезы, окрашенные уранилацетатом и цитратом свинца, изучают в электронном микроскопе УЭМВ-100 К. Обнаружение демиелинизации миелиновых волокон является одним из ведущих признаков энцефалопатических реакций и свидетельствует о выраженности токсического действия коклюшной вакцины на нервную ткань макроорганизма.

Этому способу свойственны следующие недостатки: длительность сроков исследования, трудоемкость, связанная с изготовлением срезов мозговой ткани, использование дорогостоящих приборов (электронный микроскоп), недоступных для практического здравоохранения.

Целью настоящего изобретения является упрощение способа, сокращения сроков исследования и дорогостоящих материалов.

Эта цель достигается путем иммунизации экспериментальных животных коклюшной вакциной, приготовленной по МРТУ 42-263-68 (Технические условия на приготовление коклюшной вакцины, утвержденные Минздравом СССР, 1968 г.), предварительно обработанной низкочастотным ультразвуком (42-50 кГц) в течение 5 минут, в дозе, составляющей 1,5 млрд м.т., через сутки мышей декапитируют, в мозговой ткани определяют количество гистамина и при обнаружении его от 22,8 мкг/г и выше судят о выраженности токсического действия коклюшных вакцин на нервную систему организма.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ СПОСОБА И ПРИМЕР ЕГО ОСУЩЕСТВЛЕНИЯ

Испытуемую коклюшную вакцину, приготовленную по МРТУ 42-263-68, содержащую 500 млрд м.т. в 1 мл, обрабатывают низкочастотным ультразвуком (42-50 кГц) с амплитудой колебания волновода-дезинтегратора 10-30 мкм при экспозиции воздействия 5 минут и оставляют на 24 часа при температуре 3-6С. Затем ее разводят изотоническим физиологическим раствором до концентрации, соответствующей 1,5 млрд м.т. в объеме 0,5 мл и этой дозой иммунизируют 3-5 мышей внутрибрюшинно. Через сутки мышей декапитируют в соответствии с “Правилами проведения экспериментальных работ на лабораторных животных”, забирают мозговую ткань (кора и белое вещество больших полушарий) и общепринятыми методами определяют количество свободно-активного и латерально-связанного гистамина. Изменение количества гистамина в мозговой ткани, как показатель начала патологического процесса, выбрали, руководствуясь данными, изложенными в обзорной статье Хорунжей Т.А., Бардахчьяна Э.А., Саакова Б.А. “Механизмы экспериментальной демиелинизации” (В сб. “Актуальные вопросы иммунологии и иммунопатологии”, Ростов-на-Дону, 1975, с.110-116), которые показали, что накопление свободно-активного и латерально-связанного гистамина оказывает повреждающий эффект на миелин, вызывает значительную активацию лизосомального аппарата в глиоцитах и нейронах, а также приводит к резкому повышению проницаемости гематоэнцефалитического барьера, что является пусковым механизмом в индукции экспериментального аллергического энцефаломиелита (ЭАЭ). В связи с тем, что степень нарушения сосудистой проницаемости растет, демиелинизация принимает более широкие масштабы, что в свою очередь усугубляет протеолиз, ведущий к критической точке сосудистой проницаемости и, как следствие, к массированной клеточной инфильтрации, совпадающей по времени с клинической манифестацией энцефаломиелита.

Обработка коклюшных вакцин низкочастотным ультразвуком применялась для обеспечения выхода субстанций, ответственных за энцефалитогенную активность, из бактериальной клетки, для наиболее полной оценки токсических свойств испытуемых препаратов. Для этого использовали низкочастотный ультразвук (42-50 кГц) с амплитудой колебания волновода-дезинтергратора 10-30 мкм, при экспозиции воздействия 5 минут. Выбор такого режима обусловлен тем, что низкочастотный ультразвук имеет значительные преимущества по сравнению с высокочастотным ультразвуком, так как позволяет уменьшить акустическую мощность воздействия, увеличивая экономичность исследований. Кроме того, низкочастотная трансформация энергии из акустической в тепловую позволяет предотвратить инактивацию исследуемых токсических субстанций, в состав которых входят термолабильные глюко- и липопротеины, в процессе ультразвукового воздействия (Брагинская Ф.И. “Количественные закономерности действия ультразвука на биомолекулы и клетки, и ультразвуковая спектроскопия биологических структур”. Автореф. докт. дисс., 1981, с.39).

Для отработки параметров предлагаемого способа были проведены соответствующие исследования. В этих опытах использовали коклюшные вакцины, приготовленной в соответствии с МРТУ 42-263-68 (Технические условия на приготовление коклюшной вакцины, утвержденные Минздравом СССР, 1968 г.) из производственных штаммов, полученных из Коллекции Государственного института стандартизации и контроля медицинских и биологических препаратов им. Л.А.Тарасевича (г.Москва). Высокотоксичные коклюшные вакцины были приготовлены из штаммов 688 и 703, средней токсичности – из штаммов 345 и 222 и слаботоксичная – из штамма 187.

Результаты изучения накопления гистамина в коре и белом веществе больших полушарий экспериментальных животных спустя 24 часа (1 сутки) после введения испытуемых коклюшных препаратов показали, что коклюшные вакцины из штаммов 688 и 703 индуцировали накопление гистамина в мозговой ткани мышей, которое регистрировалось от 31,8 до 34,4 мкг/г, коклюшные вакцины со средней токсичностью из штаммов 345 и 222 вызывали повышение уровня гистамина от 22,4 до 27,5 мкг/г, тогда как коклюшная вакцина, характеризующаяся низкой токсичностью, не обладала такими свойствами (табл.1). Количество гистамина в мозговой ткани животных, иммунизированных

этой вакциной, незначительно отличалось от результатов, полученных в группах животных, инокулированных 0,15 М раствором хлорида натрия (11,8 и 8,9 мкг/г соответственно).

Совершенно очевидно, что коклюшные вакцины, вызывающие накопление гистамина в мозговой ткани, который является пусковым механизмом в индукции энцефалитических расстройств вплоть до энцефаломиелитов и энцефалопатий, в практике производства коммерческих моно- и ассоциированных коклюшных вакцинных препаратов должны быть исключены.

На основании проведенных исследований выявлен ряд отличительных признаков предполагаемого способа по сравнению с прототипом, которые представлены в таблице 2.

Таким образом, как видно из таблицы 2, предлагаемый способ по сравнению с прототипом сокращает в 7 раз сроки проведения анализа, в 42,6 раза стоимость проведения анализа, а также существенно упрощает трудоемкость процесс.

Формула изобретения

Способ оценки токсичности коклюшных вакцин путем иммунизации экспериментальных животных, отличающийся тем, что мышам внутрибрюшинно вводят коклюшную вакцину, предварительно обработанную низкочастотным ультразвуком (42-50 кГц) в течение 5 мин, через 24 ч мышей декапитируют, в мозговой ткани определяют количество гистамина и при обнаружении его от 22,4 мкг/г и выше судят о выраженности токсического действия коклюшных вакцин на нервную систему организма.

MM4A Досрочное прекращение действия патента Российской Федерации на изобретение из-за неуплаты в установленный срок пошлины за поддержание патента в силе

Дата прекращения действия патента: 27.12.2004

Извещение опубликовано: 20.05.2006 БИ: 14/2006