Патент на изобретение №2227280

(54) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ РЕТИКУЛОЦИТОВ В ИНКУБИРОВАННОЙ КРОВИ ПТИЦ

(57) Реферат:

Изобретение относится к области ветеринарии. Способ включает стабилизацию крови 3,8%-ным цитратом натрия в соотношении 1 часть антикоагулянта и 4 части крови, инкубацию в состоянии покоя при 39С, смешивание крови с красителем в соотношении 3:1 ламинарно в замкнутом объеме в течение 30 с, окрашивание 1%-ным раствором красителя бриллиантовый крезиловый синий, приготовленным на физиологическом растворе, при рН 2,95-3,0 в течение 40 мин при комнатных условиях. Затем готовят мазки, которые фиксируют метанолом. Подсчет ретикулоцитов производят на 1000 эритроцитов по группам зрелости с использованием анализатора изображений. Предлагаемый способ позволяет выявить ретикулоциты 1, 2, 3 и 4 классов и эритроциты. 2 табл. 4 ил.

Изобретение относится к области ветеринарии и может быть использовано для определения функциональной активности костного мозга (эритроцитарного баланса) у птиц в физиологических условиях и при действии экстремальных факторов.

Популяция эритроцитов представляет собой разнородную цитологическую систему, состоящую из функционально морфологически и кинетически различающихся клеток [1, 2]. Определение количественного состава эритроцитарной популяции позволяет судить об уровне деятельности органов продукции и деструкции эритроцитов [3].

Поддержание эритроцитарного равновесия на нормальном или измененном уровне осуществляется благодаря механизмам, усиливающим интенсивность эритропоэза при уменьшении числа эритроцитов и снижающим его при увеличении их количества. Известна практика подсчета ретикулоцитов и определения времени их созревания для количественного изучения интенсивности эритропоэза, а тем самым и косвенного определения длительности жизни эритроцитов [4].

За прототип принят способ определения количества ежесуточно созревающих ретикулоцитов, разработанный Е.Н. Мосягиной [1, 4, 5] на млекопитающих животных, включающий отбор периферической крови в количестве 0,4 мл и внесение в стерильных условиях в хорошо парафинированную пробирку, в которую добавляют несколько крупинок порошкообразного гепарина; инкубирование гепаринизированной крови в термостате в течение 4 ч, причем для приближения к физиологическим условиям пробирку устанавливают на доске, получающей каждые 3 с движения вверх и вниз от небольшого электрического двигателя для создания имитации движения эритроцитов в кровяном русле, которое, по мнению авторов, влияет на процесс созревания ретикулоцитов; окраску инкубированной крови в количестве 0,02 мл 1%-ным красителем бриллианткрезилблау в соотношении 1:1, приготовленным на физиологическом растворе (рН 7,3) с предварительным перемешиванием на парафинированном часовом стекле парафинированной стеклянной палочкой. Часовое стекло помещают на 35 мин во влажную камеру. Затем смесь краски и крови вновь перемешивают и делают широкие мазки на чистых обезжиренных стеклах; счет ретикулоцитов в мазках ведется во всех полях зрения.

Эритроциты считаются в первом из каждых десяти полей зрения. После того, как счет будет доведен до 10 000, считают ретикулоциты дополнительно в девяти полях зрения, без выделения их в отдельные группы по степени зрелости [4].

Способ не получил широкого распространения вследствие невысокой точности и физиологически необъяснимых различий в данных о нормальных значениях числа ретикулоцитов у человека и животных, полученных при различных способах окраски ретикулоцитов. Более того, в литературе отсутствуют данные относительно изучения интенсивности эритропоэза у птиц на основании подсчета инкубированных ретикулоцитов, а нормы количества ретикулоцитов в физиологических условиях также значительно варьируют по данным разных авторов. Поскольку ретикулоциты проходят в периферической крови все стадии созревания, их ретикулум постепенно исчезает, и чем совершеннее окраска и микроскопическая техника, тем на более поздней стадии созревания можно отличить ретикулоцит от зрелого эритроцита.

Недостатком прототипа является его практически абсолютная непригодность для оценки эритроцитарного баланса у птиц, т.к. в процессе суправитальной окраски гепаринизированной инкубированной крови 1%-ным красителем бриллиантовым крезиловым синим ускоряется свертываемость крови, на мазках обнаруживаются тени клеток, вокруг которых появляются характерные ореолы. Большинство клеток погибает, ретикулоциты не идентифицируются. Подсчет ретикулоцитов во всех полях зрения ограничен спецификой приготовления мазка, которая предполагает наличие на нем тонких и толстых участков; в связи с этим при микроскопировании более толстых частей мазка, где клетки накладываются друг на друга (у птиц к тому же эритроциты ядерные, что создает лишние помехи), вычленение ретикулоцитов становится достаточно сложным.

Литературный анализ позволил раскрыть причины непригодности существующего метода, обусловленные особенностями протекания химических реакций в среде между красителем, антикоагулянтом и биологической тканью птиц: 1) кровь птиц по сравнению с млекопитающими животными отличается повышенной свертываемостью вследствие высокого содержания ионов Са²⁺ [6], выполняющих на начальном этапе свертывания крови функцию активаторов протромбина. Добавление в среду антикоагулянтов приводит к осаждению ионов Са²⁺ и стабилизации крови; 2) снижение АТФ в среде в процессе инкубации пробы крови приводит к нарушению кальциевого обмена и деструкции клеточных компонентов, способствуя увеличению внеклеточного Са²⁺ в среде, повышению свертываемости крови и гибели клеток [8]; 3) молекула гепарина, обладая сильными кислотными свойствами, несет отрицательный заряд и реагирует с основными красителями (к числу которых относится бриллиантовый крезиловый синий), при этом она инактивируется и теряет способность замедлять процесс свертывания [7].

Все это приводит к гибели клеток, появлению на мазках ореолов и теней клеток, загрязненных комплексом гепарина с красителем. Таким образом, при окрашивании крови птиц краситель и гепарин одновременно теряют свои свойства, что приводит к невозможности идентификации ретикулоцитов.

Задачей предлагаемого изобретения является создание атравматичного способа определения количества ретикулоцитов в инкубированной крови птиц для оценки функциональной активности костного мозга.

Для достижения поставленной задачи в способе, включающем стабилизацию крови гепарином, инкубацию крови в течение 4 ч при температуре тела с периодическим покачиванием, окрашивание 1%-ным раствором красителя бриллиантовый крезиловый синий, приготовленным на физиологическом растворе (рН 7,3), в соотношении 1:1 на парафинированном часовом стекле во влажной камере с предварительным перемешиванием парафинированной стеклянной палочкой, подсчет количества ретикулоцитов на 10 000 эритроцитов, предлагается стабилизацию крови производить 3,8%-ным цитратом натрия в соотношении 1 часть антикоагулянта и 4 части крови; инкубацию крови производить в биологическом термостате при 39С в течение 4 ч в состоянии покоя; перемешивание крови с 1%-ным красителем бриллиантовым крезиловым синим (3:1) производить ламинарно в замкнутом объеме, например в пробирке, в течение 30 с; окрашивание при рН 2,95-3,0 производить в течение 40 мин на воздухе при 18-20С; фиксацию мазков, приготовленных на чистых обезжиренных стеклах, осуществлять 2-3 каплями метанола до полного растекания спирта по поверхности стекла; счет ретикулоцитов производить по группам зрелости на 1000 эритроцитов с использованием анализатора изображений.

При использовании в качестве антикоагулянта цитрата натрия не обнаружены морфологически измененные эритроциты (разбухшие, звездчатой формы и т.п.), ретикулярная субстанция четко идентифицируется. Стабилизация инкубированной крови цитратом натрия позволяет также избежать появления излишней грязи на мазках и артефактов, так как удается предупредить повышенную свертываемость крови птиц, исключить инактивацию молекулы красителя; в итоге прокрашиваются внутриклеточные структуры, содержащие рибонуклеопротеиды.

Проведение инкубации при 39С позволяет поддержать в условиях in vitro близкие к естественным физиологические параметры исследуемой крови. Предшествующее окрашиванию ламинарное перемешивание крови с красителем в замкнутом объеме, например в пробирке, способствует снижению травмируемости клеток и позволяет избежать появления артефактов на мазке, так как эритроциты птиц менее устойчивы к механическим повреждениям, чем млекопитающих.

Разведение инкубированной крови с красителем в соотношении 3:1 снижает ошибку эксперимента (при использовании разведения 1:1 получаются мазки с ограниченным числом эритроцитов, что предполагает необходимость приготовления двух мазков для одного и того же объекта). Фиксация мазка позволяет его длительно хранить и при необходимости многократно исследовать.

Использование в процессе подсчета ретикулоцитов анализатора изображений позволяет производить счет ретикулоцитов по степени зрелости на 1000 эритроцитов вместо 10000 благодаря специальной программе, разработанной фирмой “ВидеоТесТ”, и высокой точности прибора, позволяющих получать достоверные результаты и экономить время исследования. Определение количества ретикулоцитов различной степени зрелости обеспечивает получение информации об эритропоэзитической деятельности костного мозга и его функциональных возможностях [9].

Отличительными признаками заявленного способа являются использование для стабилизации крови в качестве антикоагулянта 3,8%-ного цитрата натрия в соотношении 1 часть антикоагулянта и 4 части крови, инкубирование в биологическом термостате в состоянии покоя при температуре 39С, ламинарное перемешивание в замкнутом объеме, например в пробирке, крови с красителем (3:1) в течение 30 с, проведение окраски в пробирке при рН 2,95-3,0 в течение 40 мин на воздухе при комнатных условиях (18-20С), фиксация приготовленного на чистом обезжиренном стекле мазка двумя-тремя каплями метанола до полного растекания, подсчет ретикулоцитов по степени зрелости на 1000 эритроцитов с использованием анализатора изображений.

Пример определения количества ретикулоцитов в инкубированной крови птиц. В пробирку налить 0,1 мл 3,8%-ного цитрата натрия и 0,4 мл крови, осторожно, но тщательно перемешать. Инкубировать в состоянии покоя в биологическом термостате при 39С в течение 4 ч. В пробирку налить 0,1 мл 1%-ного раствора бриллиантового крезилового синего, приготовленного на физиологическом растворе (0,9% хлорида натрия) и 0,3 мл инкубированной крови, осторожно перемешать в течение 30 с. Окрашивать при рН 2,95-3,0 в течение 40 мин при комнатных условиях (18-20С). Сделать мазки на чистых обезжиренных стеклах. Зафиксировать двумя-тремя каплями метанола до полного растекания спирта по поверхности стекла. Высушить на воздухе. Микроскопировать под иммерсией. Подсчет ретикулоцитов по степени зрелости вести на 1000 эритроцитов, используя анализатор изображений.

Предлагаемый способ позволяет выявлять ретикулоциты и эритроциты. Ретикулоциты – в виде вытянутых эллипсоидов, окрашенных в бледно-зеленый цвет с ядром от светло-синего до фиолетового цвета и синей сеточкой, имеющей различную конфигурацию в ретикулоцитах разной степени зрелости: ретикулоциты 1-го класса – сеточка заполняет всю цитоплазму и накладывается на ядро (фиг.1); ретикулоциты 2-го класса – сеточка густо заполняет всю цитоплазму, при этом не накладывается на ядро (фиг.2); ретикулоциты 3-го класса – сеточка расположена в основном вокруг ядра, иногда в виде эксцентрично лежащих клубков (фиг.3); ретикулоциты 4-го класса – сеточка в виде нитевидных образований и отдельных включений, рассеянных по всей цитоплазме (фиг.4). Эритроциты – бледно-зеленого цвета с интенсивно синим ядром, без внутриклеточных включений. Результаты исследований приведены в таблицах 1 и 2.

Как видим, в условиях физиологической регенерации системы крови в связи с особенностью эритропоза птиц, который при нормобластическом типе кроветворения предполагает поступление недозревших форм эритроцитов в периферическую кровь, где завершается процесс их формирования, присутствуют ретикулоциты третьего и четвертого классов (см. табл. 1). Причем ритм регенераторных процессов системы эритрона (интенсивность эритропоэза) у отдельной особи будет зависеть от лабильности и адаптационных возможностей нервных структур, а также функционального резерва костного мозга птицы.

При возмущающих воздействиях показатели костно-мозгового кроветворения свидетельствуют о мощном выбросе молодых форм клеток в кровоток. Усиление катаболических процессов при стрессе приводит к сдвигам в скорости созревания ретикулоцитов – сокращению времени их созревания и ускорению периода полувыведения эритроцитов из кровотока вследствие высокой повреждаемости клеток эритроцитарной популяции под воздействием стресс-гормонов. В соответствии с этим изменяется интенсивность эритропоэза, выражающаяся в увеличении костно-мозговой продукции и появлении ретикулоцитов первого и второго классов (см. табл. 2).

Литература

1. Мосягина Е.Н. Кинетика форменных элементов крови/Мосягина Е.Н., Владимировская Е.Б., Торубарова Н.А., Мызина Н.В. – М.: Медицина, 1976, 272 с.

2. Илюхин А.В. Цитокинетика и морфология кроветворения при хроническом облучении/Илюхин А.В., Шашаков B.C., Бурковская Т.Е., Зуббенова Э.С. – М.: Энергоиздат, 1982, 136 с.

3. Гительзон И.И., Терсков И.А. Исследование эритрона как управляемой организмом клеточной системы/Вопросы биофизики, биохимии и патологии эритроцитов/Под ред. Г.М.Франка. – М.: Наука, 1967, с. 48-62.

4. Мосягина Е.Н. Эритроцитарное равновесие в норме и патологии. – М.: Медгиз, 1962, 271 с.

6. Сельскохозяйственная птица/Под ред. Э.Э.Пеншонтневича. – М.: Изд-во с/х лит-ры, 1962, т. 1, 383 с.

7. Зубаиров Д.М. Биохимия свертывания крови. – М.: Медицина, 1978, 174 с.

8. Ашкинази И.Я. Разрушение эритроцитов/Руководство по физиологии системы крови. Фиизиология эритропоэза. – Л.: Наука, 1979, с. 274-334.

9. Яновский Д.Н. Картина крови и ее клиническое значение. – Киев, 1957, 543 с.

Формула изобретения

Способ определения ретикулоцитов, включающий стабилизацию, инкубацию крови в течение четырех часов, окраску инкубированной крови 1% красителем бриллианткрезилблау, приготовленном на физиологическом растворе, подсчет ретикулоцитов в высушенных мазках, сделанных на предметных стеклах, отличающийся тем, что кровь птиц стабилизируют 3,8% цитратом натрия в соотношении 4:1, инкубацию крови проводят в состоянии покоя при 39С, кровь перемешивают с красителем ламинарно в соотношении 3:1 в замкнутом объеме, например, в пробирке, в течение 30 с, окрашивание производят при рН 2,95-3,0 в течение 40 мин на воздухе при температуре 18-20С, высушенные мазки фиксируют метанолом, подсчет ретикулоцитов ведут по степени их зрелости на 1000 эритроцитов, используя анализатор изображений, причем ретикулоциты выглядят как вытянутые эллипсоиды бледно-зеленого цвета с ядром от светло-синего до фиолетового цвета и синей сеточкой, имеющей различную конфигурацию в ретикулоцитах разной степени зрелости: в ретикулоцитах 1 класса – сеточка заполняет всю цитоплазму и накладывается на ядро, в ретикулоцитах 2 класса – сеточка густо заполняет всю цитоплазму, при этом не накладывается на ядро, в ретикулоцитах 3 класса – сеточка расположена в основном вокруг ядра, иногда в виде эксцентрично лежащих клубков, в ретикулоцитах 4 класса – сеточка в виде нитевидных образований и отдельных включений, рассеянных по всей цитоплазме, а эритроциты бледно-зеленого цвета с интенсивно синим ядром без внутриклеточных включений.

РИСУНКИ

MM4A – Досрочное прекращение действия патента СССР или патента Российской Федерации на изобретение из-за неуплаты в установленный срок пошлины за поддержание патента в силе

Дата прекращения действия патента: 17.07.2006

Извещение опубликовано: 10.06.2007 БИ: 16/2007