Патент на изобретение №2150836
|
||||||||||||||||||||||||||
(54) ШТАММ ГРИБА ENTOMOPHTHORA THAXTERIANA N19-11 (ВИЗР) ДЛЯ ПОЛУЧЕНИЯ БИОПРЕПАРАТА МИКОАФИДИН Т
(57) Реферат: Изобретение относится к области сельскохозяйственной микробиологии и может быть использовано при получении препарата микоафидин Т для защиты растений от тлей, паутинных клещей и трипсов. Штамм Entomophthora thaxteriana 19-11 (ВИЗР) получают путем ступенчатого отбора из моноконидиального рассева природного изолята, выделенного из персиковой тли. Отбор проводят по признаку токсинообразования изолятов этого гриба при культивировании в глубинных условиях. Штамм Entomophthora thaxteriana депонирован в коллекции чистых культур ВИЗР под 19-11. Выход микоафидина Т у штамма составляет 2,5-2,6 г с 1 л питательной среды, состоящей из 4% глюкозы, 1% соевой муки и воды (остальное). Содержание микоафидина Т в биомассе 19,4-19,5%. Применение биопрепарата позволяет снизить концентрацию рабочей эмульсии препарата до 0,5%. Инсектицидная активность 90-100% гибели вредителей сельскохозяйственных культур в открытом и закрытом грунте. 2 табл. Изобретение относится к области сельскохозяйственной микробиологии и может быть использовано при получении препарата микоафидин T для защиты растений от тлей, паутинных клещей и трипсов. В качестве ближайшего аналога выбран штамм гриба Entomophthora thaxteriana Petch. N 18 (Zygomycetes: Enteromophthorales) (ВИЗР) (авт.св. N 1658432), являющийся продуцентом токсических веществ – основы биопрепаратов, однако в процессе сохранения и многократных пересевов данный штамм утратил свои токсинообразующие свойства и снизилась его биологическая эффективность по отношению к насекомым-вредителям. Задача изобретения состоит в получении нового штамма гриба, обладающего более высоким (по сравнению с известным) уровнем образования токсических веществ и инсектицидной активностью против сосущих вредителей. Штамм Entomophthora thaxteriana N 19-11 (ВИЗР) получен путем ступенчатого отбора из моноконидиального рассева природного изолята, выделенного из персиковой тли. Отбор проведен по признаку токсинообразования изолятов этого гриба при культивировании в глубинных условиях. Штамм Entomophthora thaxteriana депонирован в коллекции чистых культур ВИЗР под N 19-11. Выход микоафидина T у штамма составляет 2,5 – 2,6 г с 1 литра питательной среды, состоящей из 4% глюкозы, 1% соевой муки и воды (остальное). Содержание микоафидина T в биомассе 19,4 – 19,5%. Морфологические признаки Вегетативный мицелий штамма несептированный, бесцветный, распадающийся через 24 часа на короткие прямые или изогнутые гифенные тела. Образование конидиеносцев с конидиями происходит на субстратном мицелии. Конидиеносцы короткие, бесцветные, неразветвленные, с одной конидией на конце. Конидии сферические с сосочком у основания содержат одно крупное или несколько мелких жировых включений. Размеры конидий 25 – 39 х 21 – 32 мкм, в среднем 32 х 26 мкм. Конидии имеют однослойную клеточную стенку, гладкую поверхность. Формирование покоящихся спор начинается к 66 часам роста. Покоящиеся споры округлые с двойной оболочкой и крупной жировой каплей в центре. Размеры покоящихся спор 20 – 25 мкм, в среднем 22 мкм. Поверхность спор гладкая, клеточная стенка трехслойная. Культурально морфологические признаки штамма изучены на сусло (50% неохмеленное пивное сусло), средах Сабуро (1% пептон и 4% глюкозы) и соевой (1% соевой муки и 4% глюкозы). На всех указанных средах штамм образует плоские, гладкие и бесцветные колонии, которые при 24-часовом освещении покрываются налетом конидий, что придает колониям белый цвет. Пигмент в среду не выделяется. Характер поверхностного роста гладкий. Скорость роста колонии в стандартных условиях (pH 6,5 – 7,0; температура выращивания 22oC) на сусло и среде Сабуро 3,0 мм/сутки, на соевой среде – 2,8 мм/сутки. Выход микоафидина T для штамма E. thaxteriana N 18 составляет 4,99% или 0,35 г/л питательной среды соответственно. Инсектицидную активность определяли экспресс-методом, описанным в “Методике испытаний микоафидина T в лабораторных, полевых и производственных условиях” (составители: Воронина Э.Г., Мукамолова Т.Ю. и др., Ленинград – Пушкин, 1988). Метод состоит в следующем: в чашку Петри диаметром 40 мм на фильтр, смоченный 0,3 мл раствора препарата, помещали тлей, учет гибели проводили через 1 час контакта с обработанной поверхностью, количество повторностей – 4 – 5 чашек, число насекомых в чашке 20 – 30 особей. Эффективность действия препаратов на личинок табачного трипса определяли экспресс-методом, аналогичным для тлей. Обработку паутинных клещей проводят путем окунания листьев фасоли с клещами в 1% водную эмульсию препаратов. Листья затем помещают в чашки Петри с водой для предотвращения разбегания клещей, гибель учитывают через 24 часа. В таблицах 1, 2 приведены инсектицидная активность и выход препаративных форм штаммов гриба E. thaxteriana N 18 и N 19-11. Таким образом, штамм Entomophthora thaxteriana N 19-11 обладает повышенным уровнем токсинообразования и биологической эффективности, что позволяет снизить концентрацию рабочей эмульсии препарата, полученного на его основе, до 0,5% для достижения 90 – 100% гибели вредителей сельскохозяйственных культур в открытом и закрытом грунте. Цвет На агаризированных питательных средах (Сабуро, соевой и сусло) штамм образует бесцветные колонии. Пигмент в среду не выделяется. Хорошо спорулирующая колония имеет белый цвет за счет обильного белого налета из конидий. Физиологические признаки Пигмент не образуется и в среду не выделяется. Из источников углерода хорошо усваивает глюкозу, мальтозу, крахмал, фруктозу (на них отмечен наилучший рост и споруляция). На среде с аминокислотами может расти без углеродов за счет углеродной части аминокислот, однако рост слабый и споруляция отсутствует. Плохо растет и спорулирует на средах, содержащих сахарозу, лактозу, галактозу, арабинозу, ксилозу и спирты. Из источников азота усваивает смеси аминокислот, пептиды, белки, может расти на средах с аспарагином. Нитратный азот не усваивает, на средах с аммонийным азотом – рост слабый. Температура Рост отмечался в диапазоне температур + 3 – 36oC. Температурный оптимум для роста 27oC, для конидиеобразования 20 – 22oC. Микроаэрофильный рост Штамм является строгим аэробом. Проверка жизнеспособности штамма осуществляется пересевом культуры на свежий сусло-агар с последующим выращиванием в термостате при 22oC. Способ сохранения Продолжительность выращивания на косяках сусло-агара 7 – 8 суток, после чего штамм может храниться без пересевов 1 – 1,5 года. Способ консервации Штамм может храниться на косяках сусло-агара при +4oC в течение 1 – 1,5 лет без пересева. В Госколлекции микроорганизмов ИБФМ АН России штамм хранится в жидком азоте 3 года без потери жизнеспособности. Наличие маркерных признаков Штамм продуцирует два вида эндотоксинов и обладает избирательным токсическим действием. Продуктивность E. thaxteriana N 19-11 по микоафидину T составляет 2,5 – 2,6 г/л среды, инсектицидная активность 98 – 100% в различных вариантах с тест-насекомыми. Уровень токсинообразования штамма является стабильным признаком: после 16 генераций токсигенность штамма и эффективность образцов препаратов остается на первоначальном уровне. Пример. Штаммы E. thaxteriana N 18 и N 19-11 выращивают на среде, содержащей 1% соевой муки и 4% глюкозы, вода – остальное (pH 6,5 – 7,0) при 27oC в течение 3 суток. Биомассу отфильтровывают, высушивают при температуре 37oC (до воздушно-сухого состояния) и размалывают. Выделение микоафидина T из 1 г биомассы проводят этанолом в течение 60 мин. Полученные растворы отделяют фильтрованием от биомассы и выпаривают спирт до полного его удаления. Выход микоафидина T для штамма E. thaxteriana N 19-11 составляет 19,4% или 2,53 г/л питательной среды соответственно. Формула изобретения
РИСУНКИ
MM4A Досрочное прекращение действия патента Российской Федерации на изобретение из-за неуплаты в установленный срок пошлины за поддержание патента в силе
Дата прекращения действия патента: 02.12.2003
Извещение опубликовано: 10.12.2004 БИ: 34/2004
|
||||||||||||||||||||||||||
