Патент на изобретение №2226398

(54) ПИТАТЕЛЬНАЯ СРЕДА ДЛЯ УСКОРЕННОГО ОПРЕДЕЛЕНИЯ ЛЕКАРСТВЕННОЙ УСТОЙЧИВОСТИ МИКОБАКТЕРИЙ ТУБЕРКУЛЕЗА

(57) Реферат:

Изобретение относится к области медицины, а именно к фтизиобактериологии. Сущность изобретения: разработана питательная среда для микобактерий туберкулеза (МБТ) для определения их лекарственной устойчивости на основе модифицированной синтетической среды Сотона, которая дополнительно содержит 0,35% питательного агара и 25% лошадиной сыворотки. Технический результат: среда позволяет получить визуально видимый рост МБТ в 2,1-2,8 раза быстрее (на 3-5-е сутки), чем на известной среде. Предлагаемая среда может быть использована в практике фтизиобактериологических лабораторий для ускоренного получения данных о лекарственной устойчивости клинических штаммов МБТ к изониазиду, стрептомицину, рифампицину. 2 табл.

Изобретение относится к медицине, а именно к области фтизиобактериологии, и может быть использовано для определения лекарственной устойчивости микобактерий туберкулеза.

Разработка методов и сред для ускоренного определения лекарственной устойчивости является важной задачей современной фтизиобактериологии, особенно в условиях подъема лекарственной устойчивости, наблюдающегося в последние годы [1, 2]. Общеизвестно, что чем ранее начата адекватная химиотерапия, тем быстрее наступает излечение больного, поэтому клиницисты очень заинтересованы в быстром получении данных о лекарственной устойчивости МБТ, выделенных от пациента.

Учет результатов определения лекарственной устойчивости стандартным непрямым методом абсолютных концентраций на плотной яичной среде Левенштейна – Йенсена производится на 14-21-й день после посева культуры МБТ [3, 4]. Ускоренный метод определения лекарственной устойчивости на плотной яичной среде Попеску по нитратредуктазной активности применим только для Mycobacterium tuberculosis, но не для M.bovis, не имеющего данного фермента [5].

На жидких средах МБТ растут быстрее. Так, бульон Миддлбрука используется для определения лекарственной устойчивости в таких системах, как ВАСТЕС, МВ-ВАСТ, BBL-MGIT. Индикация роста МБТ в этих системах осуществляется радио-, коло- и флюорометрическими методами на 3-10-е сутки после посева культуры [6, 7, 8]. Перечисленные системы, использующие жидкую среду, очень дороги и доступны немногим хорошо оснащенным референс-лабораториям. Так, стоимость 1 флакона со средой МВ-ВАСТ превышает 100 руб., системы BBL-MGIT – около 1 у.е., система ВАСТЕС требует дорогого аппаратурного обслуживания и небезопасна радиологически.

Полужидкие среды используются в практике некоторых фтизиобактериологических лабораторий только для выделения измененных форм МБТ – L-форм [9].

В целях ускоренного определения лекарственной устойчивости штаммов МБТ перспективно использование полужидких сред с добавлением оптимальных количеств ростовых и питательных факторов и противотуберкулезных препаратов.

Прототипом предлагаемой среды является жидкая синтетическая среда Сотона [3], с помощью которой определяют лекарственную устойчивость. Но в практике фтизиобактериологии она, как и другие жидкие среды [3], используется в крайне редких случаях из-за неудобства применения или сложности и трудоемкости считывания результата: 1) визуально – по росту поверхностной пленки на 10-14-21-й день, при этом теряется преимущество среды в скорости роста; 2) по мазку из осадка – процедура, увеличивающая опасность внутрилабораторного заражения и требующая длительного времени.

Таким образом, преимущество предлагаемой среды в сравнении с наиболее близкими: 1) быстрота получения результатов – 3-7 суток; 2) дешевизна; 3) доступность любой фтизиобактериологической лаборатории, так как необходимые для нее ингредиенты постоянно используются в повседневной практике этих лабораторий; 4) безопасность – не требуются дополнительные манипуляции, такие, как высев, микроскопия для верификации роста; 5) простота считывания результата, которое осуществляется визуально.

Задачей предлагаемого изобретения является разработка питательной среды для ускоренного определения лекарственной устойчивости штаммов МБТ к трем основным препаратам – стрептомицину, изониазаду, рифампицину.

Задача решается за счет того, что в жидкую модифицированную среду Сотона добавляют 0,35% питательного агара и 25% лошадиной сыворотки.

Приготовление питательной среды для определения лекарственной устойчивости МБТ.

Основу среды представляет модифицированная жидкая синтетическая среда Сотона [10], в которую добавляют питательный агар и после стерилизации – лошадиную сыворотку. Конечная концентрация агар-агара в предлагаемой среде около 0,08%, то есть среда близка по консистенции к жидкой, что наряду с оптимальной концентрацией вносимой лошадиной сыворотки обусловливает быстрый рост МБТ, а агар-агар не дает инокуляту опускаться на дно, повышая локальную концентрацию микроорганизмов. Это обеспечивает быструю визуализацию роста – начальные его признаки на 3-5-е сутки, отчетливые – на 5-7-е сутки в зависимости от особенностей штамма.

Состав питательной среды, г:

Калий двухосновный фосфорнокислый 0,5

Магнезия сернокислая 0,05

Железо лимоннокислое аммиачное 0,05

Натрий лимоннокислый 2,0

L-аспарагин 4,0

Глицерин, мл 60

Питательный агар 3,5

Дистиллированная вода До 1 л

Смесь подогревают до полного растворения солей, разливают в колбы по 300 мл и стерилизуют в автоклаве при 1 атм (120°С) 30 мин. В остывшую полужидкую основу асептически добавляют 100 мл лошадиной сыворотки (к 300 мл основы, что составляет 25%). Затем полужидкую среду разливают в 4 колбы по 100 мл: 1 – контроль, без противотуберкулезных препаратов; 2 – с 1 мл стрептомицина в концентрации 1000 мкг/мл; 3 – с 1 мл изониазида в концентрации 100 мкг/мл; 4 – с 1 мл рифампицина в концентрации 2000 мкг/мл. Разведения препаратов производят стандартно [3, 4]. Конечные концентрации химиопрепаратов равны: стрептомицина – 10 мкг/мл, изониазида – 1 мкг/мл, рифампицина – 20 мкг/мл, то есть данные концентрации идентичны тем, которые используются в стандартном непрямом методе абсолютных концентраций. Затем среду с противотуберкулезными препаратами и без них разливают асептически по 4 мл. Пробирки должны быть закрыты резиновыми пробками без лунок.

Определение лекарственной устойчивости МВТ.

Готовят суспензию исследуемого штамма МБТ в физиологическом растворе по стандарту мутности 5 ед., разводят ее в 10 раз и вносят в пробирки с полужидкой средой в объеме 0,2 мл. Инокулят засевают поверхностно по стенке пробирки без перемешивания и встряхивания. Посевы инкубируют при 37°С в течение 7 дней. Учет результатов производят визуально. МБТ растут в верхней части среды в виде взвеси или облачка очень мелких и более крупных крошковидных колоний. При чувствительности культуры МБТ к препарату роста нет, среда остается равномерно прозрачной. При резистентности штамма МБТ к противотуберкулезным препаратам результат можно учитывать при появлении первых признаков роста, то есть на 3-5-е сутки, при чувствительности – не ранее 7 суток (срок, при котором наблюдается наибольший процент совпадений результатов, полученных с помощью данной среды и стандартной среды Левенштейна – Йенсена).

Испытание предлагаемой среды проведено на 242 клинических штаммах МБТ, выделенных из патологического материала больных туберкулезом органов дыхания и его внелегочными формами. Лекарственную устойчивость исследовали параллельно на предлагаемой среде и стандартным методом на среде Левенштейна – Йенсена.

Результаты определения скорости роста МБТ на предлагаемой среде по сравнению со средой Левенштейна – Йенсена представлены в табл. 1.

Как видно из приведенных данных, срок начального и отчетливого роста, определяемого визуально, на полужидкой среде в 2,1 и 2,8 раза меньше такового на среде Левенштейна – Йенсена, что делает предлагаемую среду перспективной для ускоренного определения лекарственной устойчивости.

В табл. 2 представлены данные исследования лекарственной устойчивости с помощью предлагаемой среды и стандартным методом на среде Левенштейна – Йенсена. Статистически достоверных различий между ними нет.

Таким образом, проведенные исследования показали, что использование предлагаемой полужидкой среды в 2,1-2,8 раза сокращает сроки роста МВТ в сравнении со средой Левенштейна – Йенсена, используемой для определения лекарственной устойчивости стандартным методом, и дает высокий процент сходимости результатов. Поэтому для ускоренного определения устойчивости МБТ к основным противотуберкулезным препаратам – стрептомицину, изониазиду, рифампицину целесообразно использовать предлагаемую полужидкую среду.

Источники информации

3. Ященко Т.Н., Мечева И.С. Руководство по лабораторным исследованиям при туберкулезе. – М.: Медицина, 1973.

4. Приказ №558 от 8.06.1978. Об унификации микробиологических методов исследования при туберкулезе. – М., 1978.

9. L-формы микобактерий туберкулеза/ Под ред. З.Н.Кочемасова. – М.: Медицина, 1980.

10. Щеголева Р.А. Модификация жидкой питательной среды Сотона для выращивания микобактерий туберкулеза. Лаб. дело. – 1989, №5, с.78 и 79.

Формула изобретения

Питательная среда для ускоренного определения лекарственной устойчивости микобактерий туберкулеза, содержащая солевой состав модифицированной питательной среды Сотона, отличающаяся тем, что она содержит дополнительно 0,35% питательного агара и 25% лошадиной сыворотки при следующем составе компонентов:

Полужидкая основа:

Калия двухосновного фосфорнокислого 0,5 г

Магнезии сернокислой 0,05 г

Железа лимоннокислого аммиачного 0,05 г

Натрия лимоннокислого 2,0 г

L-аспарагина 4,0 г

Глицерина 60 мл

Питательного агара 3,5 г

Дистиллированной воды До 1 л

Лошадиной сыворотки 100 мл/300 мл полужидкой основы

MM4A Досрочное прекращение действия патента Российской Федерации на изобретение из-за неуплаты в установленный срок пошлины за поддержание патента в силе

Дата прекращения действия патента: 31.07.2005

Извещение опубликовано: 20.06.2006 БИ: 17/2006