Патент на изобретение №2225981

(54) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ПОЛИАМИНОВ В БИОЛОГИЧЕСКОЙ ЖИДКОСТИ

(57) Реферат:

Изобретение относится к медицине, а именно к лабораторной диагностике. Сущность способа: определяют концентрацию полиаминов в спермоплазме путем экстрагирования их из исследуемого материала, выпаривания экстракта, растворения его с последующим электрофоретическим разделением, окраской раствором нингидрина и количественным определением путем денситометрии, при этом электрофоретическое разделение полиаминов проводят в 1,5%-ном агаровом геле в 0,1 М лимонно-кислом буфере с рН=3,4, при напряжении 200 В и силе тока 40 мА в течение 1 ч 30 мин. Способ обладает высокой чувствительностью и точностью, доступен для широкого практического применения. 2 табл.

Изобретение относится к области медицины, а именно биохимии, и может быть использовано, в частности, для определения полиаминов в спермоплазме.

В практической медицине известен способ определения полиаминов по флюоресценции их производных путем денситометрии фотонегативов хроматограмм после разделения дансилированных экстрактов биологического материала хроматографическим методом в тонких слоях селикагеля или способ превращения полиаминов в бензоильные производные с последующим определением методом ВЭЖХ с обращенными фазами или способ определения полиаминов на готовых пластинках Силуфол UV-254 с последующей флюорометрией фракций дансильных производных полиаминов на автоматизированном микроскопе-анализаторе ПРОТВА-С (“ЛОМО”) (Чудинов А.А., Чудинова Л.А., Коробов В.П. Метод определения низкомолекулярных олигоаминов в различном биологическом материале. Вопросы медицинской химии. 1984, №4, с. 127, 128. Asotra S., Miadenov P.V., Burke R.D. Improved method for benzoyl chloride derivatization of polyamines for high-performance liquid chromatography. J. Chromatog. 1987, 408, р. 227-233. Сяткин С.П., Березов Т.Т. Микрометод флюорометрического определения содержания полиаминов и путресцина в тканях животных тонкослойной хроматографией на пластинках Силуфол UV-254. Вопросы медицинской химии. 1981, №6, с. 848, 849).

Недостатками этих способов являются сложность, трудоемкость, длительность выполнения и стадий анализа, необходимость использования специального дорогостоящего оборудования и реактивов.

Наиболее близким способом к предлагаемому является способ определения полиаминов в биологических жидкостях, включающий экстрагирование полиаминов из биологической пробы, выпаривание, растворение, проведение электрофореза на ацетатцеллюлозной пленке и определение количественного содержания путем денситометрии (Способ определения полиаминов в биологических жидкостях. RU 95106030, опубл. 10.01.1998).

Данный способ имеет следующие недостатки: требует относительно длительного проведения всего анализа в целом (13 часов), не является достаточно точным, так как имеет невысокую чувствительность и низкую воспроизводимость, низкую четкость и низкое качество результатов разделения фракций, требует для количественного определения полиаминов дополнительной обработки и пропитки ацетатцеллюлозной пленки, т.е. дополнительных манипуляций и использования дополнительных реактивов.

Целью представленного изобретения является повышение воспроизводимости, увеличение чувствительности, точности, сокращение времени проведения анализа при одновременной простоте и доступности для широкого практического применения.

Поставленная цель в изобретении достигается тем, что электрофоретическое разделение полиаминов проводят в 1,5%-ном агаровом геле в 0,1 М лимонно-кислом буфере с рН=3,4, при напряжении 200 В и силе тока 40 мА в течение 1 ч 30 мин.

Электрофоретическое разделение полиаминов проводят в достаточно кислой среде (рН=3,4), так как при этом значении рН полиамины заряжаются положительно и движутся к катоду.

Электрофоретическое разделение полиаминов проводят в 1,5% агаровом геле, потому что при такой концентрации геля происходит более значительная задержка низкомолекулярных полиаминов и наблюдается более четкое разделение фракций вследствие повышения плотности и упругости геля. Более низкая и более высокая концентрация агарового геля (больше или меньше 1,5%) приводит к ухудшению результатов разделения полиаминов и увеличению времени проведения электрофореза. Электрофоретическое разделение полиаминов проводят при напряжении 200 В и силе тока 40 мА, т. к. это стандартные условия для проведения электрофореза в геле. Увеличение напряжения и силы тока может привести к чрезмерному нагреванию, значительному увеличению испарения и в конечном итоге – высыханию агара. Более низкое же напряжение и сила тока уменьшают скорость электрофореза и происходит увеличение диффузионных процессов, что приводит к снижению точности и чувствительности способа. Время проведения электрофореза (1час 30 мин) является в этих условиях достаточным, т.к. при меньшем времени происходит неполное и нечеткое разделение фракций полиаминов. Применение 1,5% агарового геля с толщиной слоя 1 мм, напряжения 200 В и силы тока 40 мА дает лучшее разрешение при меньшей продолжительности эксперимента. При дальнейшей обработке быстрее также происходят окрашивание и последующее высушивание агаровых пластинок. В достигаемом при этом хорошем разделении компонентов играет роль снижение диффузионных процессов, поскольку имеет место хорошее соотношение между массой токопроводящей среды и поверхностью, через которую отводится тепло. Именно это и позволяет достичь при проведении электрофореза в агаровом геле четких результатов разделения фракций полиаминов. Прозрачность агарового слоя обеспечивает непосредственное денситометрирование. Высушенная агаровая пластинка достаточно прозрачна, поэтому ее без дополнительной обработки и пропитки помещают в денситометр и производят измерение оптической плотности, что сокращает время проведения анализа и увеличивает чувствительность и точность способа.

Таким образом, преимущество предлагаемого способа в том, что время его выполнения составляет 10 ч, что на 3 ч быстрее, чем в прототипе. Это происходит за счет сокращения стадий анализа. Кроме того, применением для электрофореза агарового геля достигается более эффективное разделение компонентов, а значит, более высокая воспроизводимость результатов, что приводит к повышению точности способа. Способ не требует для количественной оценки дополнительной обработки и пропитки высушенной агаровой пластинки, так как позволяет непосредственно проводить денситометрию, что сокращает время проведения анализа и повышает чувствительность способа. Способ доступен для широкого практического использования благодаря относительно низкой себестоимости и простоте выполнения.

Предложенный способ был успешно апробирован на 30 образцах эякулятов в практической работе кафедры общей и биоорганической химии Астраханской государственной медицинской академии в течение 2001 года.

Ниже приводятся результаты апробации.

Пример №1.

Донор спермы №7/2001. Показатели спермограммы соответствуют критериям, предъявляемым экспертной группой ВОЗ к фертильной сперме. Время разжижения 17 мин. Объем эякулята 4,5 мл. Концентрация сперматозоидов 39 млн/мл.

Определяли концентрацию полиаминов в спермоплазме по 10 параллельным исследованиям образца.

Для исследования образец спермы центрифугируют 15 мин при 12000 об/мин, чтобы осадить сперматозоиды. Подкисленную НСl надосадочную жидкость нагревают на кипящей водяной бане в течение 30 мин для осаждения белков и центрифугируют 10 мин при 12000 об/мин. Надосадочную жидкость подщелачивают 2 н. NaOH до рН 10,0. Далее экстрагируют полиамины равным объемом н-бутанола в течение 1 часа при постоянном встряхивании, после чего центрифугируют 15 мин при 12000 об/мин. Бутанольную фазу отбирают с помощью шприца, переносят в фарфоровую чашку, добавляют 2 капли 6 н. НС1 и содержимое выпаривают в сушильном шкафу при 80°С до сухого остатка. Сухой остаток растворяют в 0,2 мл 0,1 н. НС1. Стеклянные пластинки (9х12 см), залитые 1,5% агаровым гелем с толщиной слоя 1 мм предварительно обрабатывают 0,1 М лимонно-кислым буферным раствором с рН 3,4.

5 мкл конечной фракции полиаминов с помощью микропипетки вносят в лунку агаровой пластинки на расстоянии 9 см от катода и помещают в прибор для электрофореза.

Электрофоретическое разделение полиаминов проводят при комнатной температуре в 0,1 М лимонно-кислом буфере (рН 3,4) при напряжении 200 В и силе тока 40 мА в течение 1 ч 30 мин.

После электрофореза пластинку подсушивают в сушильном шкафу при 100°С в течение 30 мин, орошают нингидриновым раствором (100 мг ацетата кадмия растворяют в 10 мл дистиллированной воды, добавляют 100 мл ацетона, 1 г нингидрина, 5 мл концентрированной уксусной кислоты, встряхивают до полного растворения нингидрина) и вновь помещают в сушильный шкаф на 1 ч 30 мин при 100°С.

Полиамины определяют в виде розовато-фиолетовых пятен и количественно определяют путем денситометрии. Из полиаминов в спермоплазме определены спермин в концентрации 2,34±0,08 г/л и спермидин в концентрации 1,15±0,01 г/л. Средняя ошибка по спермину и спермидину составляет 0,30 и 0,23 соответственно, а размах варьирования равен 0,40 и 0,15. Полученные данные представлены в таблице 1.

Пример №2.

Донор спермы №33/2001. Показатели спермограммы соответствуют критериям, предъявляемым экспертной группой ВОЗ к фертильной сперме. Время разжижения 12 мин. Объем эякулята 4,0 мл. Концентрация сперматозоидов 49 млн/мл.

Определяли концентрацию полиаминов в спермоплазме по 10 параллельным исследованиям образца по описанному выше способу. Полиамины определяют в виде розовато-фиолетовых пятен и количественно определяют путем денситометрии. Из полиаминов в спермоплазме определены спермин в концентрации 1,97±0,09 г/л и спермидин в концентрации 0,89±0,07 г/л. Средняя ошибка по спермину и спермидину составляет 0,31 и 0,20 соответственно, а размах варьирования равен 0,43 и 0,11. Полученные данные представлены в таблице 1.

Пример №3.

Донор спермы №37/2001. Показатели спермограммы соответствуют критериям, предъявляемым экспертной группой ВОЗ к фертильной сперме. Время разжижения 15 мин. Объем эякулята 3,1 мл. Концентрация сперматозоидов 45,5 млн/мл.

Определяли концентрацию полиаминов в спермоплазме по 10 параллельным исследованиям образца по описанному выше способу. Полиамины определяют в виде розовато-фиолетовых пятен и количественно определяют путем денситометрии. Из полиаминов в спермоплазме определены спермин в концентрации 2,77±0,10 г/л и спермидин в концентрации 1,08±0,005 г/л. Средняя ошибка по спермину и спермидину составляет 0,35 и 0,20 соответственно, а размах варьирования равен 0,5 и 0,13. Полученные данные представлены в таблице 1.

Предлагаемым способом достигается положительный эффект: повышается точность определения полиаминов за счет увеличения чувствительности, повышается воспроизводимость при одновременном использовании не дорогого оборудования и реактивов, простоте и доступности для широкого практического применения, сокращается число стадий анализа, а, следовательно, и время проведения всего анализа на 3 ч, по сравнению с прототипом (см. таблица 2).

Предлагаемый способ может быть использован в фундаментальной и практической медицине для определения полиаминов в спермоплазме.

Формула изобретения

Способ определения полиаминов в биологической жидкости путем экстрагирования их из исследуемого материала, выпаривания экстракта, растворения его с последующим электрофоретическим разделением, окраской раствором нингидрина и количественным определением путем денситометрии, отличающийся тем, что определяют концентрацию полиаминов в спермоплазме, при этом электрофоретическое разделение полиаминов проводят в 1,5% агаровом геле в 0,1 М лимоннокислом буфере с рН 3,4 при напряжении 200 В и силе тока 40 мА в течение 1 ч 30 мин.