Патент на изобретение №2225864

(54) МЕТАБОЛИТЫ ЭКТЕЙНАСЦИДИНА-743, ФАРМАЦЕВТИЧЕСКАЯ КОМПОЗИЦИЯ НА ИХ ОСНОВЕ И СПОСОБЫ ЛЕЧЕНИЯ

(57) Реферат:

Изобретение относится к новым соединениям-метаболитам эктейнасцидина, а именно ЕТМ-305, ЕТМ-204 и ЕТМ-775, имеющим следующие структурные формулы:

Эти соединения являются сильными противоопухолевыми агентами. Изобретение также относится к фармацевтическим композициям на основе этих соединений и способам лечения злокачественных опухолей. Технический результат: получение новых противоопухолевых агентов. 10 с.п. ф-лы, 23 ил., 2 табл.

Эктейнасцидины (в заявке введено сокращение Et или Et s) являются чрезвычайно мощными противоопухолевыми агентами, выделенными из морских оболочников Ecteinascidia turbinata. В частности, Ets 729, 743 и 722 характеризуются многообещающей эффективностью in vivo, включая активность против мышиного лейкоза Р388, меланомы В16, карциномы легкого Левиса (Lewis) и некоторых моделей ксенотрансплантатов опухолей человека у мышей.

Выделение и характеристика природного Et 743 представлены в Патенте США №5 089 273, который цитируется в данной заявке. Получение синтетического Et 743 изложено в Патенте США №5 721 362, который включен в данною заявку в виде ссылки.

Противоопухолевая активность соединений эктейнасцидина, в частности, Et 729 и Et 743, хорошо документирована в научной литературе. Например, Goldwasser et al. Proceedings of the American Association for Cancer Research. 39: 598 (1998); Kuffel et al. Proceedings of the American Association for Cancer Research. 38: 596 (1997); Moore et al. Proceedings of the American Association for Cancer Research. 38: 314 (1997); Mirsalis et al. Proceedings of the American Association for Cancer Research. 38: 309 (1997); Reid et al. Cancer Chemotherapy and Pharmacology. 38: 329-334 (1996); Faircloth et al. European Journal of Cancer, 32A, Supp. 1, pp. S5 (1996); Garcia-Rocha et al. British Journal of Cancer. 73: 875-883 (1996); Eckhardt et al. Proceedings of the American Association for Cancer Research. 37: 409 (1996); Hendriks et al. Proceedings of the American Association for Cancer Research. 37: 389 (1996); описания которых включены в данную заявку в виде ссылки.

Эктейнасцидин 743 (Et 743) имеет следующую структуру:

Ввиду выраженной противоопухолевой активности соединений этого класса продолжаются исследования родственных структур, которые могут характеризоваться такой же или более высокой противоопухолевой активностью. Данное изобретение, направленое на выделение и характеристику природных метаболитов Et 743, является результатом этих продолжающихся исследований.

Проведены очистка и выяснение структур некоторых продуктов метаболизма Et 743 цитохромом CYP3A4 человека. В описании эти соединения обозначены как “ЕТМ” с последующим цифровым значением, которое представляет собой приблизительную молекулярную массу.

Например, ЕТМ 305 и ЕТМ 775 выделены из смеси метаболитов, полученной при биохимическом исследовании, проведенном в Департаменте аналитической химии (Analytical Chemistry Department) при PharmaMar, Испания. Подобное исследование метаболитов, выполненное Mayo Clinic, привело к идентификации ЕТМ 204. Эти метаболиты эктейнасцидина имеют следующие структуры:

Для лучшего понимания данного изобретения представлены рисунки, сопровождающие это описание, в которых

фиг.1 представляет собой спектр ¹H ЯМР (500 МГц) ETM-SiOH-1 (неполярная примесь) в СDСl₃;

фиг.2 представляет собой хроматограмму высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) ETM-SiOH-4 (ЕТМ 775);

фиг.3 представляет собой хроматограмму ВЭЖХ ЕТМ-SiOH-3 (ETM 305);

фиг.4 представляет собой хроматограмму ВЭЖХ ЕТМ-SiOH-2 (метаболиты, встречающиеся в виде следов);

фиг.5 представляет собой FAB-масс-спектр низкого разрешения ETM 305 в М.В. (волшебное поле);

на фиг.6 представлен ESI-масс-спектр ETM 305;

на фиг.7 представлен спектр ¹H ЯМР (750 МГц) ETM 305 в СD₃ОD;

фиг.8 представляет собой FAB/MS/MS-спектр ETM 305;

фиг.9 представляет собой ультрафиолетовый (УФ) спектр ETM 305;

фиг.10 представляет собой УФ спектр ETM;

фиг.11 представляет собой FAB масс-спектр низкого разрешения ETM 775 в М.В.;

фиг.12 представляет собой ESI-масс-спектр ETM 775 (положительный режим);

фиг.13 представляет собой ESI-масс-спектр ETM 775 (отрицательный режим);

фиг.14 представляет собой FAB/MS/MS-спектр ETM 775 (m/z 138-302);

фиг.15 представляет собой FAB/MS/MS-спектр ETM 775 (m/z 440-620);

фиг.16 представляет собой спектр ¹H ЯМР (750 МГц) ETM 775 в CD₃OD;

фиг.17 представляет собой УФ спектр ETM 775;

фиг.18 представляет собой ВЭЖХ-хроматограмму ЕТМ 305;

фиг.19 представляет собой УФ спектр ЕТМ 305;

фиг.20 представляет собой ESI-масс-спектр ЕТМ 305;

фиг.21 представляет собой ESI-масс-спектр ЕТМ 204;

фиг.22 представляет собой спектр ¹Н ЯМР (500 МГц) ЕТМ 204 в СD₃ОD;

фиг.23 представляет собой ESI/MS/MS-спектр ЕТМ 204.

Исследование метаболитов Et 743.

А. Получение смеси метаболитов – ЕТМ:

Et-743 (50 мкМ) инкубировали в присутствии 0,4 мг/мл изоформы CYP3A4, экспрессированной лимфобластами человека (Gentest Corporation, Woburn, МА) в 0,1 М трис-HCl буфере (рН 7,4), содержащем NADPH-образующую систему (0,4 мМ NADP⁺, 25 мМ глюкозо-6-фосфата, 0,5 Ед/мл глюкозо-6-фосфат-дегидрогеназы и 3,3 мМ хлористого магния). После четырех (4) часов инкубации при 37С реакцию останавливали ацетонитрилом, охлажденным льдом, и твердые вещества удаляли центрифугированием (12000 д, 4 минуты). Супернатанты анализировали с помощью ВЭЖХ.

В. Очистка ЕТМ 305 и ЕТМ 775

2,6 мг ЕТМ (полученного на стадии А, выше) растворяли в небольшом количестве СНСl₃ и наносили на колонку с силикагелем (8100 мм стеклянная колонка, заполненная суспензией силикагель/СНСl₃). Сначала колонку элюировали СНСl₃, за которым следовали смеси СНСl₃/МеОН (98, 96, 94, 92 и 90%). Собрано всего десять опытных пробирок (3 мл каждая), которые объединяли на основании данных TLC (тонкослойной хроматографии) для получения четырех фракций (Таблица 1). Как установлено по спектру ¹Н ЯМР, менее полярная и нетоксичная фракция (ETM-SiOH-1, 2 мг) состоит из липида, структурно не связанного с Et 743 (фиг.1).

Оставшиеся цитотоксичные фракции в дальнейшем очищали с помощью ВЭЖХ (Phenomenex-Ultracarb ODS, 10 мкм, 10150 мм, 3:1 МеОН/Н₂O 0,02 М NaCl, 1 мл/минуту, определение Da: 210, 220, 254 и 280 нм). Наиболее полярная фракция (ETM-SiOH-4, 0,2 мг) давала выход 0,1 мг ЕТМ 775 (Фигура 2). ETM-SiOH-3 давала выход 0,3 мг ЕТМ 305 (фиг.3), a ETM-SiOH-2 состояла из комплексной смеси метаболитов в следовых количествах (фиг.4).

^a TLC на силикагеле с использованием СНСl₃/МеОН, 9:1, в качестве подвижной фазы. ^b 30% ингибирования при 250 нг.

С. Структура ЕТМ 305

С помощью FAB/MS высокого разрешения в ЕТМ 305 (IC₅₀ 0,2 мкм/мл в отношении клеток L 1210) обнаружен молекулярный ион при 306.0977 (фиг.5). Эти данные соответствуют молекулярной формуле C₁₅H₁₆NO₆ (0,1 mmu). Анализ ESI/MS подтвердил молекулярную массу ЕТМ 305 (фиг.6); молекулярный ион при m/z 306 обнаружен вместе с его натриевым аддуктом (m/z 328). Спектр ¹H ЯМР ЕТМ 305 (фиг.7) оказался очень важным для установления структурного распределения. Резонансы при 2,04; 2,28 и 6,09 оказались почти идентичными резонансам Ме-6 ( 2,03), -ОСОСН₃ ( 2,29) и протонам диоксиметилена ( 6,11 и 6,01) в Et 743, ¹ соответственно.

Кроме того, отмечены резонансы, соответствующие единице -CH=CH-NHCHO ( 7,09, дуплет, 1Н, J=15 Гц; 6,19, дуплет, 1Н, J=15 Гц; 8,04, синглет, 1Н)², и дополнительной метильной группе ( 2,52, синглет, 3Н). Химический сдвиг этой метильной группы достаточно хорошо соответствует сдвигу метильной группы ацетофенона³ ( 2,55). Интересно отметить, что спектр ¹H ЯМР ЕТМ 305 состоит из двух серий резонансов (соотношение 4:1), обусловленных ротационными превращениями вокруг связи -NH-CHO. Данные ¹H ЯМР вместе с данными MS позволяют предположить, что ЕТМ 305 имеет систему ароматических колец В-единицы Et 743, присоединенную к винилформамидной единице и к метилкетону, как показано на Схеме 1. FAB/MS/MS no m/z 306 подтвердила предполагаемую структуру (Фигура 8).

Схема 1

Р. Структура ЕТМ 775

С помощью HRFAB/MS высокого разрешения в ЕТМ 775 (IC₅₀ 0,2 мкг/мл в отношении клеток L1210) выявлен молекулярный ион при 776.2489 (фиг.11). Эти данные соответствуют молекулярной формуле C₃₉H₁₂N₃O₁₂S ( 0,0 mmu), что свидетельствует о том, что ЕТМ 775 является продуктом окисления Et 743. Как положительный, так и отрицательный режим спектра ESI/MS, оба подтвердили молекулярную массу ЕТМ 775 (фиг.12 и 13). Из-за ограниченного количества ЕТМ 775 установление структурного распределения осуществлено, главным образом, интерпретацией данных масс-спектроскопии. FABMS/MS по М+Н ЕТМ 775 (m/z 776) оказалась решающей для локализации дополнительного кислорода, который был локализован на N-2 в форме N-оксида, что установлено по пикам около m/z 276 и 260 (кислород-276). Ион фрагмента около m/z 232, не установленный в Et 743, позволяет предположить, что карбиноламин кислород окисляется до амида (Схема 3). Структуры А- и С-единиц в ЕТМ 775 оставались интактными, что установлено по присутствию характерных масс-спектральных пиков по m/z 204 (А-единица) и m/z 224 и 250 (С-единица). ¹ Оба спектра 750 750 Mhz ¹Н ЯМР (Фигура 16) и УФ (фиг.17) похожи на спектры Et 743.¹

Схема 2

II. Et 743 Исследование метаболитов, проведенное Мауо

А. Метаболит M1 (ETM 305)

Образец ETM отфильтровывали с помощью CIS-sep-pack и элюанта (3:1 МеОН/Н₂О), концентрировали в потоке азота. При очистке полученного остатка методом ВЭЖХ (такие же условия, как вышеописанные) установлено присутствие соединения с временем удерживания подобным времени удерживания ETM 305 (фиг.18). Как УФ (фиг.19), так и ESI/MS-спектры Ml (фиг.20) были идентичны спектрам ETM 305. Таким образом сделано заключение, что метаболит Ml имеет такую же химическую структуру, как и ETM 305.

В. Метаболит М2 (ЕТМ 204).

Данный образец отфильтровывали с помощью CIS-sep-pack и элюата (3:1 МеОН/Н₂О), концентрировали в потоке азота и полученный остаток анализировали с помощью FAB/MS, ESI/MS и ¹H ЯМР.

С. Структура ЕТМ 204 (М2)

С помощью FAB/MS высокого разрешения в ЕТМ 204 выявлен молекулярный ион около 204.1024. Эти данные согласуются с молекулярной формулой C₁₂H₁₄NO₂ ( 0,0 mmu). ESI/MS анализ подтвердил молекулярную массу 204 (фиг.21). Молекулярная формула соответствует молекулярной формуле а-единицы в Et 743. Таким образом, полагают что химическая структура ЕТМ 204 представляет собой ароматическое производное соли аммония, представленное на Схеме 3. Это простое соединение (так же как и другие метаболиты) можно легко контролировать при исследовании разложения Et 743 in vivo.

Схема 3

Спектр ¹H ЯМР (фиг.22) ЕТМ 204 показал резонансы, которые подтверждают предполагаемую структуру: четыре ароматических сигнала ( 9,2, синглет; 7,8, дуплет, J=5 Гц и 6,8, синглет) и три метильных синглета ( 4,2, 3,9 и 2,4). ESI/MS/MS ETM 204 (фиг.23) выявила ион значительного пика при 189, соответствующий потери N-метильной группы (204-СН₃).

Биологические исследования ETM-305 и ETM-775.

Соединения ЕТМ-305 и ЕТМ-775 исследовали, используя стандартные протоколы для следующих линий клеток опухолей; Р-388 (мышиный лейкоз); А-549 (карцинома легкого человека); НТ-29 (аденокарцинома толстой кишки человека); и MEL-28(злокачественная меланома человека). См., например, Вегgeron et al., Biochem. Biophys. Res. Comm., 1984, 121 (3) 848-854 и Schroeder et al., J. Med. Chem., 1981, 24, 1078-1083. Эти результаты представлены ниже в табл.2.

Способы лечения

Данное изобретение включает в себябиоактивные соединения, и, соответственно, данное изобретение направлено на способы лечения с применением таких соединений. Как описано выше, соединения данного изобретения проявляют in vitro цитотоксичность в отношении линий клеток опухолей. Ожидают, что эта активность in vitro будет также проявляться при использовании in vivo.

В основном эти соединения выделены в чистом виде, то есть со степенью чистоты достаточной для определения физических и биологических свойств. Обнаружено, что эти соединения характеризуются специфической противоопухолевой активностью и как таковые будут использоваться в качестве медицинских препаратов для млекопитающих, в особенности человека. Таким образом другой аспект данного изобретения касается фармацевтических композиций, содержащих активные соединения, идентифицированные в изобретении, и способов применения таких фармацевтических композиций для лечения.

Как описано выше, активные соединения данного изобретения проявляют противоопухолевую активность. Так, данное изобретение также обеспечивает способ лечения любого млекопитающего, пораженного злокачественной опухолью, чувствительной к этим соединениям, который включает в себя введение пораженному индивидуму терапевтически эффективного количества активного соединения или смеси соединений, или их фармацевтических композиций. Данное изобретение также относится к фармацевтическим препаратам, которые содержат в качестве активного ингредиента одно или более соединений данного изобретения, а также к способам их получения.

Примеры фармацевтических композиций включают в себя любую твердую (таблетки, пилюли, капсулы, гранулы и так далее) или жидкую (растворы, суспензии или эмульсии) композицию с составом, пригодным для перорального, местного или парентерального введения, и они могут содержать чистое соединение или в комбинации с любым носителем других фармацевтически активных соединений. При необходимости, когда вводят парентерально, эти композиции могут быть стерильными.

Как используют в данном изобретении, термины “стандартная доза” подразумевает физически отдельные единицы, подходящие в качестве единичной дозировки для животного, каждая доза, содержащая предопределенное количество активного вещества, рассчитанного с тем, чтобы вызвать желаемое противоопухолевое действие в сочетании с необходимым разбавителем, то есть носителем или наполнителем. Спецификации для новой стандартной дозы соединения данного изобретения продиктованы (а) особыми свойствами активного вещества или определенным противоопухолевым действием, которое достигается, и (в) ограничениями, свойственными данному этапу составления такого активного препарата для противоопухолевого применения животным, или непосредственно зависят от этого.

Единичные дозированные лекарственные формы обычно готовятся с использованием замороженного или высушенного активного соединения (или его соли), диспергируя его в физиологически толерантном (то есть приемлемом) растворителе или наполнителе, таком как вода, солевой раствор или забуференный фосфатом физиологический раствор, чтобы создать водную композицию. Такие растворители хорошо известны в данной области и обсуждаются, например, в Remington s Pharmaceutic Sciences, 16^th Ed., Mack Publishing Company, Easton, PA (1980) на страницах 1465-1467.

Дозированные формы могут также включать в себя адъювант как часть разбавителя. Адъюванты, такие как полный адъювант Фрейнда (CFA), неполный адъювант Фрейнда (IFA) и квасцы являются веществами хорошо известными в данной области и коммерчески доступными из нескольких источников.

Количество активного соединения, которое вводят, зависит, кроме прочего, от вида животного, которое лечат, размера животного, которое лечат, размера опухоли (если известно), типа имеющейся опухоли (например, с лидной) и способности субъекта утилизировать активное соединение. Точное количество активного соединения, необходимое для введения, зависит от заключения лечащего врача и личных свойств каждого индивидуума, особенно в случае, когда индивидуумом, которого лечат, оказывается человек. Однако, диапазон доз может характеризоваться терапевтически эффективной концентрацией в крови и может простираться приблизительно от концентрации 0,01 мкМ до 100 мкМ, предпочтительно приблизительно от 0,1 мкМ до 10 мкМ.

Соответствующие схемы для первоначального введения и бустер инъекций также варьируют, однако типичная схема заключается в первоначальном введении, за которым следуют повторные дозы, вводимые с помощью последующих инъекций с одночасовым или более продолжительными интервалами, или посредством другого способа введения. Альтернативно предполагают, что непрерывное внутривенное вливание является достаточным для поддержания терапевтически эффективной концентрации в крови.

Ссылки:

Следующие основные ссылки предназначены для того, чтобы помочь читателю понять это изобретение. В необходимой степени содержание этих работ упоминалось в описании путем цитирования.

A) Rinehart et al. J. Org. Chem. 1990, 55, 4512. В) Rinehart et al. J. Am. Chem. Soc. 1996, 118, 9017.

Herbert et al. J. Chem. Soc. Perkin Trans. I, 1987, 1593.

Pretsch et al. Tables of Spectral Data for Structure Determination of Organic Compounds; Springer-VerIa: Berlin, 1989; p. H125.

Rinehart et al. Biochem. Res. Commun. 1984, 124, 350.

Данное изобретение описано подробно, включая его предпочтительные аспекты. Однако будет высоко оценена попытка специалистов в данной области при рассмотрении данного описания внести модификации и/или улучшения этого изобретения в рамках и духе представленного изобретения.

Формула изобретения

1. Существенно чистый ЕТМ-305, имеющий следующую структуру:

2. Существенно чистый ЕТМ-204, имеющий следующую структуру:

3. Существенно чистый ЕТМ-775, имеющий следующую структуру:

4. Способ лечения лейкоза млекопитающих у пациентов при необходимости такого лечения, включающий в себя введение эффективного количества ЕТМ-775 упомянутому пациенту в единичной дозированной лекарственной форме.

5. Способ лечения карциномы легкого млекопитающих у пациентов при необходимости такого лечения, включающий в себя введение эффективного количества ЕТМ-775 упомянутому пациенту в единичной дозированной лекарственной форме.

6. Способ лечения аденокарциномы толстой кишки млекопитающих у пациентов при необходимости такого лечения, включающий в себя введение эффективного количества ЕТМ-775 упомянутому пациенту в единичной дозированной лекарственной форме.

7. Способ лечения злокачественной меланомы млекопитающих у пациентов, при необходимости такого лечения, включающий в себя введение эффективного количества ЕТМ-775 упомянутому пациенту в единичной дозированной лекарственной форме.

8. Фармацевтическая композиция, обладающая противоопухолевой активностью и содержащая ЕТМ-305 и фармацевтически приемлемый носитель, разбавитель или наполнитель.

9. Фармацевтическая композиция, обладающая противоопухолевой активностью и содержащая ЕТМ-775 и фармацевтически приемлемый носитель, разбавитель или наполнитель.

10. Способ изучения метаболизма эктейнасцидина 743 цитохромом CYP3A4 человека, включающий в себя мониторинг тестируемого образца на наличие одного или более метаболитов, выбранных из группы, состоящей из ЕТМ-204, ЕТМ-305 и ЕТМ-775.

РИСУНКИ