Патент на изобретение №2225725

(54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ЦЕРУЛОПЛАЗМИНА

(57) Реферат:

Изобретение относится к медицине, а именно к технологии получения медицинских препаратов из плазмы крови человека. Сущность способа: осадок VI-1 спиртовой фракции плазмы крови по Кону гомогенизируют в растворе хлористого натрия, проводят тепловую денатурацию белковых примесей, сорбцию полученного раствора на ДЭАЭ-целлюлозе, элюцию раствором хлористого натрия с концентрацией, не превышающей 0,1 М, осаждение примесей смесью этилового спирта и хлороформа, отделение их центрифугированием, осаждение целевого продукта этиловым спиртом, растворение осадка, стерилизующую фильтрацию, пастеризацию и лиофильное высушивание раствора церулоплазмина. На стадии растворения осадка целевого продукта в раствор добавляют маннитол в количестве 0,05-0,15 мг/мг белка, что позволяет получить препарат с высокой ферментативной активностью – не менее 12 ед/мг.

Изобретение относится к технологии получения фермента крови человека – церулоплазмина и может быть использовано при производстве медицинских препаратов.

Известен способ получения церулоплазмина, защищенный авторским свидетельством SU 1826193, кл. А 61 К 37/47, 35/16, опубликованное 10.09.95.

Способ предусматривает гомогенизацию спиртовой фракции плазмы крови по схеме Кона в растворе хлористого натрия, сорбцию гомогената на ДЭАЭ-сорбенте, элюцию раствором хлористого натрия, осаждение примесей смесью этилового спирта и хлороформа, отделение их центрифугированием, осаждение целевого продукта этиловьм спиртом, растворение осадка, стерилизующую фильтрацию и лиофильное высушивание.

Недостаток способа – снижение ферментативной активности целевого продукта в процессе производства.

Наиболее близким к заявляемому по технической сущности и достигнутому результату, выбранным в качестве прототипа, является способ получения церулоплазмина, защищенный патентом РФ № 2162338, кл. А 61 К 38/48, 35/16, опубликованным 27.01.01.

Способ предусматривает гомогенизацию осадка IV-1 спиртовой фракции плазмы крови по схеме Кона в растворе хлористого натрия, тепловую денатурацию белковых примесей, сорбцию полученного раствора на ДЭАЭ-целлюлозе, элюцию раствором хлористого натрия с концентрацией, не превышающей 0,1 М, осаждение примесей смесью этилового спирта и хлороформа, отделение их центрифугированием, осаждение целевого продукта этиловым спиртом, растворение осадка, стерилизующую фильтрацию и пастеризацию раствора церулоплазмина и лиофильное высушивание.

Недостатком способа является то, что при лиофильном высушивании происходит значительная, до 50%, потеря ферментативной активности препарата. Задача, решаемая предлагаемьм изобретением, – совершенствование способа получения церулоплазмина.

Технический результат заключается в повышении качества целевого продукта за счет увеличения его ферментативной активности.

Указанный результат достигается тем, что в способе получения церулоплазмина из плазмы крови человека путем гомогенизации осадка IV-1 спиртовой фракции плазмы крови по Кону в растворе хлористого натрия, тепловой денатурации белковых примесей, сорбции полученного раствора на ДЭАЭ-целлюлозе, элюции раствором хлористого натрия с концентрацией, не превышающей 0,1 М, осаждения примесей смесью этилового спирта и хлороформа, отделения их центрифугированием, осаждения целевого продукта этиловым спиртом, растворения осадка, стерилизующей фильтрации, пастеризации и лиофильного высушивания раствора церулоплазмина на стадии растворения осадка целевого продукта в раствор добавляют маннитол.

Способ осуществляется следующим образом. В качестве исходного сырья используют спиртовый осадок IY-1 плазмы крови человека. Осадок разводят в растворе, содержащем 0,1 М хлористого натрия. Устанавливают рН раствора равным 6,0-6,5 и прогревают его в течение 2 ч при температуре 60С для достижения денатурации белковых примесей. В полученный раствор, охлажденный до 20С, вносят сорбент ДЭАЭ-сефадекс (“Pharmacia-Biotek”, Швеция). Корректируют рН смеси до 6,0-6,5. Смесь перемешивают около 2 ч при температуре 20С. Сорбент отмывают 500 л охлажденного 0,1 М раствора хлористого натрия (из расчета 50 л на 1 кг сырья) до достижения оптической плотности промывных вод, измеряемой при длине волны 280 нм, не выше 1,0. Отмытый от балластных белков сорбент помещают в емкость и заливают охлажденным 0,3±0,05 М раствором хлористого натрия, перемешивают и отделяют полученный раствор церулоплазмина от сорбента. Корректируют рН полученного раствора до 5,2-5,3 и добавляют хлороформ до конечной концентрации 2-4% и этиловый спирт до 24-26%. Устанавливают температуру раствора равной 24-26С и перемешивают, выпавший осадок отделяют центрифугированием. Концентрацию этилового спирта доводят до 45-55% добавлением охлажденного до 0С этилового спирта, выдерживают раствор в течение 12-18 ч при температуре -10-15С. Осадок отделяют центрифугированием, разводят в 0,15 М растворе хлористого натрия, устанавливают рН 6,5-7,5 и концентрацию белка 20-25 мг/мл и добавляют маннитол из расчета 0,05-0,15 мг на 1 мг белка. Используют маннитол марки ЧДА, соответствующий требованиям ГОСТ 8321-74. Проводят стерилизующую фильтрацию раствора церулоплазмина и пастеризацию путем инкубации при температуре +60С в течение 24 ч. Препарат разливают во флаконы и подвергают лиофильному высушиванию. Указанные пределы концентрации маннитола являются оптимальными, поскольку как их снижение, так и превышение ведет к уменьшению защитных свойств маннитола. Кроме того, превышение указанного предела концентрации маннитола ведет к затруднению растворения осадка церулоплазмина и ухудшению физических качеств лиофилизированного продукта.

Полученный указанным способом препарат церулоплазмина характеризуется более высокой ферментативной активностью – не ниже 12 ед/мг, по сравнению с препаратом, полученным по методике прототипа, чья активность не превышает 10 ед/мг.

Пример 1. К 1 кг осадка IY-1 прибавляют 10 л 0,1 М раствора хлористого натрия. Устанавливают рН 6,0 и нагревают до температуры 60С. Прогревают 2 ч при непрерывном перемешивании. Раствор охлаждают до температуры 20С и добавляют 1 л суспензии ДЭАЭ-сефадекса. Устанавливают рН 6,0 и инкубируют суспензию 2 ч при непрерывном перемешивании. Отделяют сорбент от раствора и промывают 50 л 0,1 М раствора хлористого натрия до снижения оптической плотности промывных вод при длине волны 280 нм до 1,0. Отмытый сорбент переносят в емкость, добавляют 1 л 0,3 М раствора хлористого натрия и перемешивают. Отделяют раствор от сорбента, устанавливают рН 5,2, температуру 25С. Добавляют хлороформ до конечной концентрации 2% и этиловый спирт до 25%. Перемешивают в течение 30 мин. Отделяют выпавший осадок примесей центрифугированием. К полученному центрифугату добавляют охлажденный до 0С этиловый спирт до конечной концентрации 50%. Выдерживают раствор при температуре -10С в течение 18 ч. Образовавшийся осадок отделяют центрифугированием, гомогенизируют в 0,15 М растворе хлористого натрия, устанавливают рН 7,0 и концентрацию белка 22 мг/мл. Добавляют маннитол до концентрации 0,05 мг/мг белка (0,11%). Проводят стерилизующую фильтрацию раствора церулоплазмина. Выдерживают емкость со стерильным раствором при температуре 60С в течение 24 ч. Проводят розлив и лиофильное высушивание препарата.

Определение ферментативной активности препарата, производимое по методу Равина (J. Lab. Clin. Med., 1961, v.58, p.161-168), показало, что активность препарата равняется 13,5 ед/мг белка.

Таким образом, предложенный способ получения препарата церулоплазмина позволяет повысить качество целевого продукта за счет повышения его ферментативной активности.

Пример 2. Осуществляют по методике, изложенной в примере 1, только на стадии разведения осадка целевого продукта в раствор добавляют маннитол до концентрации 0,15 мг/мг белка (0,33%). Определение ферментативной активности препарата показало оксидазную активность, равную 15 ед/мг белка.

Формула изобретения

Способ получения церулоплазмина из плазмы крови человека путем гомогенизации осадка VI-1 спиртовой фракции плазмы крови по Кону в растворе хлористого натрия, тепловой денатурации белковых примесей, сорбции полученного раствора на ДЭАЭ-целлюлозе, элюции раствором хлористого натрия с концентрацией, не превышающей 0,1 М, осаждения примесей смесью этилового спирта и хлороформа, отделения их центрифугированием, осаждения целевого продукта этиловым спиртом, растворения осадка, стерилизующей фильтрации, пастеризации и лиофильного высушивания раствора церулоплазмина, отличающийся тем, что на стадии растворения осадка целевого продукта в раствор добавляют маннитол в количестве 0,05-0,15 мг/мг белка.

PD4A – Изменение наименования обладателя патента Российской Федерации на изобретение

(73) Новое наименование патентообладателя:

Федеральное государственное унитарное предприятие “Научно-производственное объединение по медицинским иммунобиологическим препаратам “Микроген”

Извещение опубликовано: 10.09.2004 БИ: 25/2004