Патент на изобретение №2225614

(54) СПОСОБ ВЫЯВЛЕНИЯ АНТИГЕНА ВИРУСА ПАПИЛЛОМЫ ЧЕЛОВЕКА

(57) Реферат:

Изобретение относится к области медицины, в частности к вирусологии. Способ обеспечивает повышение точности выявления антигена вируса папилломы человека. Проводят взятие биопсийного материала со слизистой гортани, фиксацию его, заливку в парафин, обработку раствором Н₂О₂, промывку в буферном растворе, нанесение поликлональных антител, далее нанесение конъюгированных антител к вирусу папилломы человека и окрашивание гемотоксилином, при этом берут мазки со слизистой гортани “эпителиальной щеточкой”, фиксируют их в ацетоне в течение 10-15 мин, затем обрабатывают 1% бычьим сывороточным альбумином, содержащим 0,5% ТРИТОН Х-100, в течение 20-25 мин, после чего наносят моноклональные антитела к вирусу папилломы человека, а антиген вируса папилломы человека выявляют в световом микроскопе по наличию светло- и темно-коричневых гранул в клетках слизистой оболочки. 1 ил., 1 табл.

Изобретение относится к области медицины, а именно к диагностике респираторного папилломатоза, и может быть использовано для выявления и лечения данной патологии.

Респираторный папилломатоз – тяжелейшее заболевание в оториноларингологии, интерес к которому не только не снижается, но и постоянно растет. Значимость проблемы респираторного папилломатоза связана с тем, что, поражая гортань, папилломатозный рост приводит к сужению ее просвета, нарушению жизненно важных функций органа – дыхательной и голосообразования. Развивающаяся в связи с этим хроническая респираторная гипоксемия – стенотическая болезнь – имеет место в несформировавшемся растущем организме, являясь причиной нарушений физического, психомоторного и эмоционального развития ребенка, дисфункций различных органов и систем. Папилломы являются самой частой доброкачественной опухолью гортани у взрослых и почти единственной опухолью этого органа у детей. Будучи по гистоморфологическому строению доброкачественным образованием, у детей они чаще всего отличаются упорным рецидивированием, бурным ростом, приводящим к резкому сужению дыхательной трубки, вплоть до полного ее закрытия, угрожая тем самым жизни ребенка. В настоящее время в этиопатогенезе респираторного папилломатоза вирусная природа заболевания не вызывает сомнения и связывается с вирусом папилломы человека – ВПЧ (ДНК-содержащему из рода паповавирусов). Выявление экспрессии антигена вируса папилломы человека (ВПЧ) для идентификации ВПЧ в свежевыделенном клиническом материале, позволяет проследить связь между ВПЧ инфекцией и развитием папилломатоза гортани.

В связи с этим не вызывает сомнения необходимость выявления антигена вируса папилломы человека в слизистой оболочке гортани для подтверждения этиологии заболевания в каждом конкретном случае и осуществления контроля за эффективностью проводимого лечения.

Известным методом выявления ВПЧ является метод полимеразной цепной реакции (ПЦР), описанный [Маниатисом Т., Фрич Э., Сэмбруком Дж. Методы клеточной инженерии. Молекулярное клонирование. – М.: Мир – 1984]. Суть полимеразной цепной реакции заключается в возможности многократного копирования определенного участка ДНК с помощью ДНК-полимеразы, что дает возможность визуализировать продукты реакции в электрофорезе. Использование термостабильной ДНК-полимеразы, выделенной из Termus thermofilus, позволяет автоматизировать процедуру. Для выполнения ПЦР под наркозом при прямой ларингоскопии производят забор материала (во время оперативного вмешательства). Затем из этого материала выделяют определенный фрагмент ДНК и синтезируют фрагменты длиной 500 пар оснований при помощи праймеров определенного состава, которые отвечают за начало репликации вируса. Реакция состоит из 30 трехступенчатых циклов, протекающих при следующих условиях: 1-я ступень – 60” при 94^oС, 2-я ступень – 60” при 58^oС, 3-я ступень – 90” при 72^oС. Реакцию проводят на амплификаторе в микроцентрифужных пробирках типа “Эппендорф” объемом 500 мкл, содержащих рабочий буфер. Продукты реакции визуализируют в электрофорезе в 6% полиакриламидном геле с последующей окраской бромистым этидием.

Однако данный метод является достаточно дорогостоящим и трудоемким, так как связан с необходимостью использования специальных реагентов и проведения множества циклов. Поскольку для данного метода необходимо наличие специальной дорогостоящей аппаратуры, то данный метод может быть использован только в крупных медицинских центрах. Способ не обладает достаточной точностью.

Наиболее близким к предлагаемому нами методу является способ определения антигена вируса папилломы человека иммунопероксидазным методом, описанным [Ernest E. Lack et al. – Intervirology 14: 148-154 (1980)]. Берут парафиновые срезы с биоптатов папиллом, производят депарафинизацию срезов, обрабатывают 0,5% раствором Н₂О₂ в течение 30 минут, затем промывают в буфере, обрабатывают 20% нормальной сывороткой в течение 30 минут, наносят кроличьи антитела к вирусу ВПЧ на 45-60 минут, промывают в буфере, далее наносят коньюгированную сыворотку на 60 минут, обрабатывают диаминобензидином в течение 5-8 минут и окрашивают гематоксилином, препараты смотрят при помощи световой микроскопии.

В данном способе имеются следующие недостатки: биоптаты возможно взять только в процессе оперативного вмешательства, обработка папиллом производится в достаточно агрессивной среде (депарафинизация в ксилоле), проведение всех этапов способа достаточно длительно во времени. Взятие биоптата, его фиксация, заливка в парафин, приготовление гистологических срезов занимает 6-10 часов и 3-4 часа уходит на проведение иммунопероксидазной реакции. Недостаточная точность, вследствие использования поликлональных антител не позволяет определять отдельные серотипы вируса, что имеет значение для прогноза течения заболевания. Также имеются особенности работы с парафиновыми срезами – высокая вероятность фонового окрашивания, что затушевывает истинные результаты.

Технический результат настоящего изобретения состоит в повышении точности. Этот результат достигается тем, что при осуществлении непрямой иммунопероксидазной реакции согласно изобретению берут мазки со слизистой гортани “эпителиальной щеточкой”, фиксируют в ацетоне в течение 10-15 минут, обрабатывают 1% бычьим сывороточным альбумином, содержащим 0,5% ТРИТОН Х-100 в течение 20-25 минут, наносят моноклональные антитела к вирусу папилломы, выявление проводят в световом микроскопе по наличию светло- и темно-коричневых гранул в клетках слизистой оболочки.

Забор материала “эпителиальной щеточкой” со слизистой гортани при непрямой ларингоскопии является неинвазивным и позволяет многократно в течение лечения контролировать наличие ВПЧ в очаге поражения.

Фиксация в ацетоне позволяет сохранить структуры и устранить фоновое окрашивание при пероксидазой реакции. Обработка в 1% БСА, содержащим 0,5% Тритон Х – 100 позволяет адсорбировать загрязняющие антитела и антигены, находящиеся в тканях, а также способствует повышению проницаемости клеточных мембран, что обеспечивает лучшие условия взаимодействия моноклональных антител с антигеном ВПЧ, что еще больше повышает точность.

Использование моноклональных антител позволяет выявлять как общий антиген ВПЧ, так и отдельные серотипы (6, 11, 18), что обеспечивает высокую точность диагностики.

Сущность способа заключается в следующем: мазок берут с помощью специально приспособленной “эпителиальной щеточки” со слизистой оболочки гортани, затем фиксация в ацетоне 10-15 минут, обработка в фосфатно-солевом буфере 10 минут, далее обработка 1% бычьим сывороточным альбумином (БСА), содержащим 0,5% ТРИТОН Х-100 в течение 20-25 минут, нанесение моноклональных антител к ВПЧ в течение 45 минут при 37^oС, трехкратная промывка в буфере, по три минуты в каждом, затем нанесение вторых антител, связанных с пероксидазой, в течение 40 минут, промывка в буфере, обработка раствором, содержащим 0,05% диаминобензидин и 0,03% Н₂О₂ в течение 1-2 минут, двукратная промывка в дистилированной воде, докраска метиленовой синькой, микроскопия.

Выявление проводят в световом микроскопе по наличию темно- и светло-коричневых гранул в клетках слизистой оболочки.

Для получения достоверных результатов и исключения возможности неспецифических реакций обязательным условием является проведение контролей на качество реактивов и специфичность антисыворотки.

1. Для проведения контроля специфичности антисыворотки в качестве первого слоя наносят неиммунную сыворотку или буфер (результаты должны быть отрицательными).

2. Неспецифичность сыворотки устраняют посредством максимального разведения высококонцентрированной сыворотки и укорочения времени инкубации.

Описанный способ подкреплен примерами конкретного выполнения. Было произведено исследование мазков 20 детей с рецидивирующим папилломатозом гортани. В случаях резко положительной экспрессии антигена вируса папилломы человека клинически наблюдалось частое рецидивирование и распространенность процесса (14 случаев), а при отрицательном ответе (6 человек) – увеличение межрецидивного промежутка и переход в устойчивую ремиссию (Таблица).

Пример 1.

Больная Р. О., 15 лет, истории болезни 16273 от 23.11.1999 года с диагнозом распространенный рецидивирующий папилломатоз глотки, гортани, трахеи. Из анамнеза: больна с двухлетнего возраста, рецидивы заболевания в среднем 1 раз в 4 – 6 месяцев, в последнее время 1 раз в год. Трахеостома наложена в 6 лет. При поступлении состояние средней тяжести, дыхание через естественные дыхательные пути резко затруднено. При непрямой ларингоскопии папилломы единичные в области передней комиссуры, в трахее – на уровне края трахеотомической трубки. При непрямой ларингоскопии щеточкой взят мазок из гортани. Материал нанесен на предметное стекло, высушен и зафиксирован в ацетоне в течение 10-15 минут. Затем обработан в фосфатно-солевом буфере 10 минут, далее обработан 1% бычьим сывороточным альбумином, содержащим 0,5% ТРИТОН Х-100 в течение 20-25 минут, после этого были нанесены моноклональные антитела на 45 минут при 37^oС, троекратно промыт в буфере по три минуты в каждом, затем были нанесены вторые антитела, связанные с пероксидазой на 40 минут, промыты в буфере, обработаны раствором, содержащим 0,05% диаминобензидин и 0,03% H₂O₂ в течение 1-2 минут, затем двукратно промыт в дистилированной воде, докрашен метиленовой синькой и после этого выполнена микроскопия в световом микроскопе. При этом в мазках со слизистой гортани с помощью предлагаемого способа была выявлена четкая экспрессия антигена ВПЧ (фото 1). В настоящее время наблюдаются рецидивы в среднем один раз в год.

В результате проведенных нами исследований можно сделать следующие выводы:
1. Предложенный способ обладает высокой точностью, так как в отличие от прототипа позволяет определять отдельные серотипы вируса, отсутствует фоновое окрашивание и исключается возможность ложноотрицательных и ложноположительных результатов.

2. Обеспечивается быстрое выявление антигена (2,5-3 часа), в то время как в прототипе требуется 9-14 часов.

Таким образом, исследование 20 случаев (см. таблицу) в течение полутора лет показало хорошую воспроизводимость предлагаемого способа, что свидетельствует о его достаточной надежности. Высокая чувствительность и специфичность данного способа подтверждалась результатами ПЦР исследований и данными клинических наблюдений.

Метод достаточно прост, возможно его широкое применение в практическом здравоохранении для быстрого определения экспрессии антигена ВПЧ и соответственно оценки тяжести течения заболевания и своевременного назначения противорецидивной терапии.

Формула изобретения

Способ выявления антигена вируса папилломы человека, включающий взятие биопсийного материала со слизистой гортани, фиксацию его, заливку в парафин, обработку раствором Н₂О₂, промывку в буферном растворе, нанесение поликлональных антител, далее нанесение конъюгированных антител к вирусу папилломы человека и окрашивание гемотоксилином, отличающийся тем, что берут мазки со слизистой гортани “эпителиальной щеточкой”, фиксируют их в ацетоне в течение 10-15 мин, затем обрабатывают 1% бычьим сывороточным альбумином, содержащим 0,5% ТРИТОН Х-100, в течение 20-25 мин, после чего наносят моноклональные антитела к вирусу папилломы человека, а антиген вируса папилломы человека выявляют в световом микроскопе по наличию светло- и темно-коричневых гранул в клетках слизистой оболочки.

РИСУНКИ

MM4A Досрочное прекращение действия патента Российской Федерации на изобретение из-за неуплаты в установленный срок пошлины за поддержание патента в силе

Дата прекращения действия патента: 12.01.2004

Извещение опубликовано: 27.08.2006 БИ: 24/2006