Патент на изобретение №2224791

(54) ШТАММ БАКТЕРИЙ AZOTOBACTER VINELANDII ДЛЯ ПОЛУЧЕНИЯ БИОПРЕПАРАТА ДЛЯ БОРЬБЫ С БОЛЕЗНЯМИ ПШЕНИЦЫ, ВЫЗЫВАЕМЫМИ ГРИБНЫМИ ФИТОПАТОГЕНАМИ, И ПОВЫШЕНИЯ УРОЖАЯ

(57) Реферат:

Изобретение относится к сельскохозяйственной микробиологии, в частности к новому штамму бактерий, получению биопрепарата для снижения заболеваемости растений, вызываемых корневыми гнилями. Получен новый штамм несимбиотических азотфиксирующих бактерий Azotobacter vinelandii ИБ 1 методом аналитической селекции природных изолятов по принципу отбора продуцентов, обладающих достаточно высокой антагонистической активностью по отношению к грибам – фитопатогенам. Штамм депонирован в коллекции культур Института биологии Уфимского научного центра РАН под Az ИБ 1. Для получения препарата штамм выращивают на безазотистой среде Федорова в течение 60 ч при 28-30^oС с аэрацией до титра 10¹⁰ КОЕ/мл. Препарат, полученный на основе данного штамма, подавляет развитие заболеваний растений, вызываемых корневыми гнилями, и стимулирует рост растений за счет продуцирования гормонов роста – цитокининов в количестве 290 Нг/мл культуральной жидкости. 3 табл.

Изобретение относится к сельскохозяйственной микробиологии и касается штамма, который оказывает антагонистическое действие на возбудителей заболеваний пшеницы корневыми гнилями, и повышает урожайность пшеницы. Новый штамм может быть реализован в микробиологической промышленности для получения биопрепарата для защиты от болезней и повышения урожайности злаковых культур.

Известен штамм Pseudomonas sp. ЦМПМ В-348, используемый для получения препарата при защите злаковых от возбудителя обыкновенной корневой гнили Helminthosporium sativum /1/. Однако этот штамм неэффективен для подавления корневой гнили злаков, вызываемой комплексом грибов Fusarium spp. и Helminthosporium sativum.

Известны штаммы Pseudomonas putida, подавляющие рост фитопатогенного гриба Fusarium oxysporum /2/ и Pseudomonas putida BKM В-1743 Д, подавляющий рост грибов рода Fusarium /3/. Недостатками известных штаммов является узкий спектр антагонистического действия.

Известен штамм Azotobacter chroococcum N В-3173, предназначенный для получения бактериального удобрения /4/, повышающий урожайность злаковых культур. Недостатком является отсутствие антагонизма по отношению к фитопатогенным грибам.

Наиболее близким к заявляемому является штамм Azotobacter chroococcum 92 /5/, обладающий способностью подавлять рост некоторых фитопатогенных грибов. Недостатком штамма является узкий спектр антагонистического действия и сравнительно невысокая продуктивность.

Технической задачей изобретения является выделение нового природного штамма с широким спектром антагонистического действия на возбудителей грибных заболеваний пшеницы, обладающего высокой продуктивностью и повышающим урожайность.

Поставленная задача достигается выявлением и использованием штамма Azotobacter vinelandii ИБ 1, выделенного из образца пахотных земель, отобранного в Уфимском районе Республики Башкортостан. Штамм хранится и поддерживается в коллекции микроорганизмов Института биологии Уфимского научного центра РАН, имеет коллекционный номер Az ИБ 1.

1. Культурально-морфологические признаки.

1.1. На агаризованной питательной среде, имеющий состав, г/л: КН₂РO₄ – 0,3; СаНРO₄ – 0,2; MgSO₄ – 0,3; К₂SO₄ – 0,2; NaCl – 0,5; FeCl₃ – 0,01; СаСО₃ – 5,0; сахароза – 20 г; агар – 1,5%; смесь микроэлементов – 1 мл; дистиллированная вода до 1000 мл, рН 6,8-7, культура образует круглые колонии диаметром 3-4 мм, с гладкой блестящей поверхностью, выпуклые, прозрачные, с гладкими краями, мягкой тягучей консистенции. На 24 часу роста клетки – мелкие палочки 0,51,5 мкм, подвижные; на 48-72 часу – палочки, есть цисты, встречаются палочки клостридиальной формы.

1.2. На питательной агаризованной среде Берка, имеющий состав, г/л: К₂НРO₄ – 0,8; КН₂РO₄ – 0,2; MgSO₄ – 0,3; NaCl – 0,2; CaSO₄ – 0,1; Fe₂(MoO₄) – 0,01; глюкоза – 10 г; дистиллированная вода до 1000 мл; агар-агар – 1,5%; рН 6,8-7,0, культура образует круглые колонии диаметром 2-3 мм, с гладкой блестящей поверхностью, выпуклые, прозрачные, бесцветные, с гладкими ровными краями, однородной структуры.

1.3. На твердой питательной среде с бензойнокислым натрием в качестве единственного источника углерода рост отсутствует. При внесении бензойнокисого натрия в среду в количестве 0,15% рост хороший.

1.4. На жидкой питательной среде Федорова с мелассой, имеющей состав, г/л: К₂НРO₄ – 0,3; СаНРO₄ – 0,2; MgSO₄ – 0,3; K₂SO₄ – 0,2; NaCl – 0,5; FeCl₃ – 0,01; СаСО₃ – 5,0; меласса – 40 г; смесь микроэлементов – 1 мл; рН 6,8-7,0, выращивание при температуре плюс 281^oС и режиме аэрации-перемешивания 180 об/мин в течение 60 часов. Круглые колонии диаметром 0,5 см, выпуклые с ровными краями, слизистой консистенции.

1.5. На питательной среде КГА колонии круглые диаметром 6 мм, выпуклые, белого полупрозрачного цвета, консистенция тягучая мягкая. Пигмента не образуют. На 24 часу роста – мелкие подвижные палочки.

1.6. На питательной среде Эшби с маннитом в качестве источника углерода колонии слизистые прозрачные диаметром 3 мм, консистенция тянущаяся. На 24-48 часу роста клетки – длинные тонкие палочки 6 мкм, подвижные, встречаются палочки клостридиальной формы.

2. Физиолого-биохимические признаки.

Штамм является аэробным микроорганизмом, оптимальная температура роста 28^oС.

Отношение к источникам углерода: очень хорошо усваивает глюкозу, сахарозу; хорошо усваивает маннит, мальтозу, ксилозу, сорбит, рамнозу, лактозу, декстрин, галактозу, маннозу, глицерин, фруктозу, этанол; слабо усваивает арабинозу, мезоинозитол. Слабо растет на МПА.

Хорошо растет на среде с уксуснокислым натрием в качестве единственного источника углерода
Отношение к источникам азота: растет на безазотистых средах, сохраняя высокую продуктивность не менее 810¹⁰ кл/мл. Не погибает при нагревании при 50^oС в течение 15 мин.

Штамм не обладает фитопатогенной активностью, о чем свидетельствует отсутствие мацерации на ломтиках картофеля при нанесении на них уколом живых клеток штамма.

Штамм хранится на косяках со средой Федорова в холодильнике с пересевом на свежие косяки через 2-4 месяца, а также в лиофильновысушенном состоянии.

Штамм идентифицирован по определителю Bergey Manual of Determinative Bacteriology.

Пример 1. Для сравнения продуктивности нового штамма Az ИБ 1 с известным штаммом 92 проводили выращивание в колбах на качалке при 180-200 об/мин в течение 60 часов, при температуре 28^oС на жидкой питательной среде следующего состава, %: сахароза 3,0; К₂НРO₄ 0,03; СаНРО₄ 0,02; NaCl 0,05; СаСО₃ 0,5; K₂SO₄ 0,02. Результаты приведены в табл. 1.

Пример 2. Изучение антагонистической активности нового штамма Azotobacter vinelandii ИБ 1.

На чашки Петри с агаризованной средой КГА (картофель тертый 200 г; глюкоза 20 г; агар 20 г; вода водопроводная 1 л) высевают сплошным газоном суспензию спор грибного фитопатогена. Затем в эти же чашки уколом сажают бактерии штамма Azotobacter vinelandii ИБ 1. Чашки инкубируют при 28^oС в течение 3 суток. Учет проводят по зонам отсутствия или подавления роста гриба вокруг колонии штамма. Результаты приведены в табл. 2 и свидетельствуют о широком спектре антагонистического действия нового штамма.

Пример 3. Антагонистическое действие нового штамма против комплекса возбудителей корневых гнилей пшеницы испытывают в лабораторных условиях на пшенице сорта “Жница” с естественным уровнем заражения посевного материала, полученного в условиях опытного поля Башкирского Государственного Аграрного Университета. Посевной материал дополнительно инфицируют спорами фитопатогенных грибов Fusarium oxysporum и Bipolaris sorokiniana (титр споровой суспензии обоих патогенов составил 510⁴ КОЕ/мл). Семена пшеницы обрабатывают суспензией штамма (с титром 10⁹ КОЕ/мл) из расчета 50 мкл суспензии на 50 г семян. Семена переносят на увлажненную до полной влагоемкости полоску фильтровальной бумаги, поверх которой накладывают полоску полиэтилена, сворачивают в рулон, помещают вертикально в лабораторный стакан и оставляют при комнатной температуре. В контрольных опытах обработку семян осуществляют водопроводной водой. В качестве эталона используют известный биопрепарат – фитоспорин. Эксперимент выполняют в четырехкратной повторности. Обработку результатов проводят через 7 дней. Эффективность штамма определяют при сопоставлении степени проявления корневых гнилей проростков пшеницы в опыте и контроле. Результаты приведены в табл. 3.

Из табл. 3 следует, что новый штамм в условиях эксперимента не уступает биологическому препарату фитоспорин в эффективности воздействия на фитопатогены.

Пример 4. Определение ростстимулирующей способности заявляемого штамма.

Некоторые микроорганизмы, обитающие в ризосфере растений, способны синтезировать цитокинины. Цитокинины представляют собой природные соединения, участвующие в гормональной регуляции онтогенеза растений, характеризующиеся способностью индуцировать деление растительных клеток и являющиеся наиболее активными среди открытых рострегулирующих веществ. Образование заявляемым штаммом цитокининов характеризуется следующим примером.

Штамм бактерий Azotobacter vinelandii ИБ 1 выращивают на вышеупомянутой питательной среде Федорова. На поздней логарифмической фазе роста или в начале стационарной фазы биомассу отделяют от культуральной жидкости и супернатант анализируют на содержание цитокининов методом непрямого конкурентного иммуноферментного анализа /6/. Выполненный анализ показал наличие цитокининов в количестве 290 нг/мл культуральной жидкости заявляемого штамма. Таким образом, выделен новый штамм Azotobacter vinelandii ИБ 1, который отличается высокой продуктивностью, широким спектром антагонистического воздействия на грибные фитопатогены и способностью продуцировать цитокинины. Перечисленные полезные свойства позволяют использовать его для борьбы с грибными болезнями пшеницы и повышения ее урожайности.

Источники информации
1. Авторское свидетельство СССР 1464468, кл. А 01 N 63/00, 1988.

2. Патент США 4714614, кл. 424-93, 1987.

3. Патент RU 1805849, кл. А 01 N 63/00, 1993.

4. Авторское свидетельство СССР 1359272, кл. С 05 F 11/08, 1985.

5. Авторское свидетельство СССР 9221105, кл. С 05 F 11/08, 1982.

Формула изобретения

Штамм бактерий Azotobacter vinelandii, депонированный в коллекции микроорганизмов Института биологии Уфимского научного центра Российской Академии Наук под номером Аz ИБ 1, для получения препарата против заболеваний пшеницы, вызываемых грибными фитопатогенами, и повышения урожая.

РИСУНКИ