Патент на изобретение №2223322

(54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ РОКЕФОРТИНА И ШТАММ ДЛЯ ЕГО ОСУЩЕСТВЛЕНИЯ

(57) Реферат:

Изобретение относится к области биотехнологии и микробиологии. Предложен новый штамм Penicillium roquefortii f39, который был получен путем ультрафиолетового мутагенеза культуры Penicillium roquefortii ВКМ F-2389. Полученный штамм характеризуется высоким уровнем синтеза рокефортина и его долей в сумме алкалоидов. Также предложен способ получения рокефортина, предусматривающий культивирования штамма Penicillium roquefortii f39 в условиях аэрации и перемешивания на среде, содержащей маннит, янтарную кислоту, мочевину, MgSO₄7H₂O, КН₂PO₄ и смесь микроэлементов. Предложенный способ получения рокефортина с использованием нового штамма Penicillium roquefortii f39 позволяет существенно сократить срок культивирования и повысить выход целевого продукта. Предложенные изобретения могут быть использованы в ветеринарии, для получения алкалоида рокефортина, используемого в качестве биохимического реактива. 2 с.п.ф-лы.

Изобретение относится к области биотехнологии и микробиологии, и может быть использовано для получения алкалоида рокефортина, пригодного для использования в качестве биохимического реактива, а также в ветеринарии.

Рокефортин-10-(1.1-диметил-2-пропенил)-3-(имидазол-4-илметилен)-5, 10, 11.11-тетрагидро-2Н-пиразино[1^‘, 2^‘:1,5]пирроло[2,3-b]индол-]-1,4-(3Н, 6Н)- дион – вторичный метаболит (алкалоид, микотоксин) многих грибов рода Penicillium, для которого определены ярко выраженные нейротоксические, антибиотические и антипротозойные свойства.

Известны способы микробиологического получения алкалоида рокефортина культивированием различных грибов рода Penicillium.

Количественная оценка проводилась методом тонкослойной хроматографии путем сравнения размера пятна с пятнами, содержащими известное количество вещества, величина ошибки метода может достигать 20%. Рокефортин выделяют из гомогената мицелия экстракцией хлороформом.

В этом способе кроме рокефортина гриб-продуцент синтезировал значительное количество другого метаболита – пенитрема А. Присутствие примесей этого биологически высокоактивного соединения в препаратах рокефортина крайне нежелательно при использовании последнего в качестве биохимического реактива. Кроме того, известно, что гриб Р.commune способен вызывать аллергические заболевания у человека. Внутриклеточная локализации алкалоида осложняет процедуру его выделения необходимостью разрушения мицелия.

₂РО₄ – 10 MgSO₄7Н₂О – 0,3, раствор аммиака – до рН 5,3. Длительность культивирования 5-8 суток. Предложенная авторами процедура дробной подтитровки рН среды в интервале 6-8 в процессе культивирования позволяет увеличить содержание внеклеточного рокефортина до 100 мг/л.

Основным недостатком этого метода является использование в качестве продуцента рокефортина патогенного гриба. Известно, что Р.crustosum относится к микроорганизмам III группы патогенности и вызывает пенициллиоз (СП 1.2.011-94, утв. Госкомсанэпиднадзором РФ).

Кроме того, биосинтез целевого продукта при культивирования Р.crustosum на среде Абе носит сложный характер с несколькими максимумами и минимумами. Высокая скорость изменения концентрации рокефортина при этом осложняет выбор оптимального момента выделения алкалоида и является важной причиной низкой воспроизводимости результатов ферментацией.

Однако низкая скорость роста продуцента в предложенных условиях обуславливала большую продолжительность культивирования. Наибольшее содержание алкалоида наблюдалось на 16-20 сутки ферментации.

В случае выделения рокефортина его внутриклеточная локализация осложняет эту процедуру: необходимо механическое разрушение мицелия и многоступенчатая экстракция рокефортина с использованием двух органических растворителей – хлороформа и ацетона.

Известен продуцент рокефортина – штамм гриба Penicillium roquefortii ВКМ F-2389. (А. Г. Козловский, Т.А. Решетилова. Микробиология. 1984. Т.53, вып. 1, стр. 81-84). Однако низок уровень синтеза рокефортина, максимальное накопление требует около 10 суток культивирования.

Задача, на решение которой направлено заявляемое изобретение, заключается в создании способа микробиологического получения алкалоида рокефортина с использованием нового штамма-продуцента.

Технический результат, который может быть получен при осуществлении изобретения, заключается в том, что существенно сокращен срок культивирования.

Сущность предлагаемого способа заключается в том, что используют штамм гриба Penicillium roquefortii f 39, культивируют его в условиях аэрации и перемешивании на среде, содержащей маннит, янтарную кислоту, мочевину, MgSO₄7Н₂О, КН₂РО₄ и смесь микроэлементов в следующих количествах (г/л):
Маннит – 60,0-75,0
Янтарная кислота – 2,9-9,8
Мочевина – 2,0-5,0
MgSO₄7Н₂О – 0,1-0,5
КН₂РО₄ – 0,5-1,5
Смесь микроэлементов – 1-5 мл/л среды
Вода – До 1 л
рН (доводит раствором NaOH) – 3,8-5,5
Выделение рокефортина осуществляют известными методами.

Штамм гриба Penicillium roquefortii f39 был получен путем ультрафиолетового мутагенеза культуры Penicillium roquefortii ВКМ F-2389. Штамм гриба Penicillium roquefortii f39 хранится в коллекции грибов ИБФМ им. Г.К. Скрябина РАН.

Полученный мутантный штамм характеризовался высоким уровнем синтеза рокефортина и его долей в сумме алкалоидов (55-60% по сравнению с 15% у Р. roquefortii ВКМ F-2389). Морфологические свойства. Штамм гриба Penicillium roquefortii f39 (сусло-агар, 24С, 7 сут) образует компактные колонии 20-25 мм в диаметре с фестончатым краем, плоские, салатного цвета, растущий край белый, 1,0-2,0 мм шириной. Обратная сторона колонии телесного цвета. Культура имеет приятный грибной запах. Экссудат отсутствует. Конидиальные структуры дифференцируются относительно медленно. Кисточки типично асимметричные, несут длинные цепочки конидий. Конидиеносцы 200,0-300,04,5-5,0 мкм. Веточки 12,0-18,03,5-4,0 мкм. Метулы по 3-4 в мутовке, 10,0-12,0 3,5 мкм. Стеригмы 6,0-8,02,2-2,5 мкм. Конидии гладкие, шаровидные и полушаровидные, 3,5-4,0 мкм в диаметре.

Особенности развития штамма гриба Penicillium roquefortii f39 в сравнении с исходной культурой Р.roquefortii ВКМ F-2389 приведены в таблице
Кроме того, 1) пониженное содержание биомассы, 2) большое содержание внеклеточного рокефортина на единицу биомассы – до 3,5 мг/г (около 2,4 у дикого типа).

Предлагаемый штамм характеризуется высокой активностью образования рокефортина притом, что выделение основного количества метаболита происходит в среду.

Биосинтез рокефортина культурой Р.roquefortii f 39 стимулируется описанным выше составом среды.

Маннит в сочетании с янтарной кислотой обеспечивает возможность глубинной ферментации и накопления целевого продукта в среде, а не в мицелии.

Введение в среду мочевины стимулирует и стабилизирует биосинтез рокефортина, т. к. позволяет избежать неоднократно описанных резких и непредсказуемых изменений концентрации рокефортина в процессе роста продуцента на среде Абе. Упрощается контроль ферментации и обеспечивается высокая воспроизводимость результатов.

Гидроксид натрия вводят в среду в процессе ее приготовления для нейтрализации янтарной кислоты и создания необходимого рН.

Микроэлементы вводят в среду в виде смеси, описанной в кн. “Методы общей бактериологии”. Под ред. Ф. Герхардта и др. Т.1. 1983. М.: Мир, 347 с. Эта смесь имеет следующий состав, г:
ЭДТА – 50
ZnSO₄7H₂O – 22
CaCl₂ – 5,54
MnCl₂4H₂O – 5,06
FeSO₄7H₂O – 4,99
(NH₄)₆Mo₇O₂₄4H₂O – 1,1
CUSO₄5H₂O – 1,57
CоCl₂6H₂O – 1,61
Дистилированная вода – 1000 мл
Доводят рН до 6,0 с помощью КОН.

Осуществление способа иллюстрируется приведенными примерами, но не ограничивается ими.

Пример 1. Выращивают штамм Penicillium roquefortii f39 в ферментере АНКУМ-2 объемом 10 л на среде следующего состава (г/л): маннит – 65,0; янтарная кислота – 5,4; мочевина – 3,0; MgSO₄ 7Н₂О – 0,3; КН₂РО₄ – 1,0; смесь микроэлементов – 2 мл/л; 10%-ный раствор NaOH – до рН 4,5; вода дистиллированная.

Объем среды в ферментере составляет 6,0 л. Культивирование проводят при перемешивании, температуре 22-35С, аэрации 30-40% от насыщения, в течение 7 сут.

Для определения концентрации рокефортина культуральную жидкость фильтруют, фильтрат дважды экстрагируют равными объемами хлороформа. Хлороформный экстракт обезвоживают, концентрируют в вакууме и анализируют методом ВЭЖХ. К концу ферментации содержание рокефортина в культуральной жидкости составляет 68 мг/л.

Пример 2. Штамм Р.roquefortii f39 выращивают в ферментере АНКУМ-2 объемом 10 л на среде, указанной в примере 1, но содержание маннита в среде – 60 г/л, янтарной кислоты – 5,2 г/л, рН среды – 5,2. Объем среды в ферментере составляет 7,0 л.

Культивирование проводят при температуре 22-24^oС, аэрации 30-40% от насыщения в течение 8 сут.

К концу ферментации содержание рокефортина в культуральной жидкости составляет 52 мг/л.

Пример 3. Штамм Р.roquefortii f39 выращивают в ферментере АНКУМ -2 объемом 10 л на среде, указанной в примере 1, но содержание мочевины в среде – 5,0 г/л, рН среды – 4,0; MgSO₄7Н₂О – 0,15; КН₂РО₄ – 1,5 г/л. Культивирование проводят при 25-28^oС, аэрации 40-50% от насыщения в течение 7 сут.

К концу ферментации содержание рокефортина в культуральной жидкости составляет 72 мг/л.

Пример 4. Штамм Р.roquefortii f39 выращивают в ферментере АНКУМ -2 объемом 10 л на среде, указанной в примере 1, но содержание жирной кислоты – 2,9 г/л, мочевины в среде – 2,0 г/л; рН среды – 5,0. MgSO₄7Н₂О – 0,3; КН₂РО₄ – 0,5 г/л. Культивирование проводят при 25-28^oС, аэрации 40-50% от насыщения в течение 7 сут.

К концу ферментации содержание рокефортина в культуральной жидкости составляет 55 мг/л.

Пример 5. Штамм Р.roquefortii f39 выращивают в ферментере АНКУМ-2 объемом 10 л на среде, указанной в примере 1, но содержание мочевины в среде – 3,5 г/л, рН среды – 4,5. MgSO₄7Н₂О – 0,2; КН₂РО₄ – 0,8 г/л. Культивирование проводят при 25-28^oС, аэрации 40-50% от насыщения в течение 7 сут.

К концу ферментации содержание рокефортина в культуральной жидкости составляет 68 мг/л.

Таким образом, способ позволяет существенно сократить длительность процесса до 6-8 суток при высоком содержании целевого продукта (около 70 мг/л).

Предлагаемый способ отличается высокой степенью воспроизводимости, в нем используют непатогенный штамм, что важно для безопасности персонала.

Кроме того, обеспечивается стабильный уровень содержания рокефортина, без подтитровки рН среды. Целевой продукт накапливается в среде, что не требует разрушения мицелия и соответственно упрощает последующую стадию выделения.

Формула изобретения

1. Способ получения рокефортина, включающий культивирование гриба вида Penicillium roquefortii на среде, содержащей источники углерода и азота, и выделение известными методами, отличающийся тем, что из грибов вида Penicillium roquefortii используют штамм Penicillium roquefortii f39, культивируют его в условиях аэрации и перемешивания на среде, содержащей маннит, янтарную кислоту, мочевину, MgSO₄ 7H₂O, КН₂РO₄ и смесь микроэлементов в следующих количествах, г/л:

Маннит 60,0-75,0

Янтарная кислота 2,9-9,8

Мочевина 2,0-5,0

MgSO₄ 7H₂O 0,1-0,5

КН₂РO₄ 0,5-1,5

Смесь микроэлементов, мл/л среды 1-5

Вода, л До 1 л

рН (доводят раствором NaOH) 3,8-5,5

2. Штамм гриба Penicillium roquefortii f39 хранится в коллекции грибов ИБФМ им. Г.К. Скрябина РАН – продуцент рокефортина.

РИСУНКИ

MM4A – Досрочное прекращение действия патента СССР или патента Российской Федерации на изобретение из-за неуплаты в установленный срок пошлины за поддержание патента в силе

Дата прекращения действия патента: 25.04.2006

Извещение опубликовано: 20.03.2007 БИ: 08/2007