Патент на изобретение №2223313
|
||||||||||||||||||||||||||
(54) ДИФФЕРЕНЦИАЛЬНО-ДИАГНОСТИЧЕСКАЯ СРЕДА ДЛЯ ВЫДЕЛЕНИЯ ЛИСТЕРИЙ
(57) Реферат: Изобретение относится к медицинской и ветеринарной микробиологии и может быть использовано для бактериологической диагностики листериоза. В качестве источника азота среда содержит богатую питательными веществами основу: панкреатический гидролизат рыбной муки и панкреатический гидролизат казеина, она также содержит экстракт пекарных дрожжей, полимиксина В сульфат, акрифлавин, эскулин, соль железа, лития хлорид, натрия хлорид, агар-агар, налидиксовую кислоту и дистиллированную воду. Индикаторная система (эскулин + соль железа) позволяет легко выявить гидролиз эскулина по образованию черного венчика вокруг колоний листерий. Сбалансированность компонентного состава среды также позволяет полностью ингибировать рост сопутствующей микрофлоры и обеспечивать стабильность, высокую чувствительность среды и эффективность накопления листерий. 1 табл. Изобретение относится к области медицинской и ветеринарной микробиологии и может быть использовано для бактериологической диагностики листериоза. По данным 2000 года листериоз, поражающий как животных, так и человека, зарегистрирован в 80 странах мира, в том числе и в России /1/. Листериоз – общая проблема для медицинских и ветеринарных специалистов, так как заболеваемость у людей определенным образом связана с животными и продуктами животноводства. Установить диагноз листериоза по клинико-эпидемиологическим и эпизоотологическим данным исключительно трудно из-за полиморфизма клинических проявлений инфекции. Поэтому решающее значение приобретает лабораторная диагностика с применением специальных селективных питательных сред с целью быстрого обнаружения возбудителя листериоза при контроле мясомолочных продуктов в России и пресечения завоза возбудителя с продуктами питания из-за границы. В настоящее время для лабораторной диагностики используют мясопептонный агар (МПА) с добавлением глюкозы, теллурита калия и крови крупного рогатого скота и МПА с добавлением теллурита калия, полимиксина /2/. Недостатками этих сред является их нестабильность, так как эти среды лабораторного изготовления и, кроме того, состоят из дорогостоящих мясных переваров. Известна дифференциально-диагностическая среда для выделения листерий, содержащая в качестве источника азота панкреатический гидролизат рыбный /3/. Недостатком этой среды является нестандартность, так как эта среда лабораторного изготовления и, кроме того, для ее изготовления используются пищевые продукты. Известна питательная среда для выделения листерий, содержащая в качестве источника азота гидролизат казеина. Среда обладает высокой чувствительностью по отношению к листериям и ингибирует постороннюю микрофлору /4/. Однако эта среда лабораторного приготовления не стандартна и не доступна широкому кругу потребителей. Наиболее близкой к предлагаемой является селективная питательная среда для выделения листерий из пищевых продуктов (PALCAMagar) производства bio Merieux /4/, состоящая из следующих компонентов, г/л: Животный пептон – 23,0 Лития хлорид – 15,0 Крахмал – 1,0 Эскулин – 0,8 Железа аммонийного цитрат – 0,5 Натрия хлорид – 5,0 Акрифлавин – 0,005 Дрожжевой экстракт – 3,0 Декстроза – 0,5 Маннит – 10,0 Феноловый красный – 0,08 Полимиксин – 0,01 Цефтазидим – 0,02 Агар-агар – 10,0 Недостатком этой среды является очень высокая цена и, как следствие, невозможность использования в широкой практической лабораторной сети. Задачей изобретения является создание промышленной отечественной дифференциально-диагностической среды для выделения листерий с высокими селективными свойствами, стандартной и доступной по цене. Поставленная задача решается сбалансированностью компонентного состава среды, содержащей источник азота, экстракт пекарных дрожжей, полимиксин, акрифлавин, эскулин, соль железа, лития хлорид, натрия хлорид, агар-агар, в качестве источника азота используются панкреатический гидролизат рыбной муки (ПГРМ) и панкреатический гидролизат казеина (ПГК), а также содержит налидиксовую кислоту при следующем соотношении компонентов, г/л: Панкреатический гидролизат рыбной муки – 12,0-18,0 Панкреатический гидролизат казеина – 8,0-12,0 Экстракт пекарных дрожжей – 1,5-2,5 Лития хлорид – 14,0-16,0 Натрия хлорид – 3,0-4,0 Эскулин – 0,7-0,9 Аммонийного железа цитрат (III) – 0,45-0,55 Полимиксина В сульфат – 0,005-0,015 Налидиксовая кислота – 0,015-0,025 Акрифлавин – 0,005-0,015 Агар-агар – 12,0-14,0 Дистиллированная вода – Остальное Количественное соотношение компонентов, использование в качестве источника азота панкреатических гидролизатов рыбной муки и казеина позволяет получить сухую, стандартную питательную среду, обеспечивающую выделение листерий из инфицированного материала и четкую дифференциацию от сопутствующей микрофлоры. Селективность среды обеспечивается действием полимиксина В сульфата, акрифлавина и налидиксовой кислоты. Наличие индикаторной системы (эскулин+соль железа) позволяет легко выявить гидролиз эскулина по образованию черного венчика вокруг колоний листерий. Пример 1. Для приготовления питательной среды берут следующие навески компонентов, г/л: ПГРМ – 12,0 ПГК – 8,0 ЭПД – 1,5 Лития хлорид – 14,0 Натрия хлорид – 3,0 Эскулин – 0,7 Аммонийного железа цитрат (III) – 0,45 Полимиксина В сульфат – 0,005 Налидиксовая кислота – 0,015 Акрифлавин – 0,005 Агар-агар – 12,0 Дистиллированная вода – Остальное Навески тщательно перемешивают в 1 л дистиллированной воды, стерилизуют в автоклаве при температуре 121oС в течение 15 мин и охлаждают до температуры 45-50oС. В охлажденную среду асептически добавляют антибиотики, размешивают и разливают в стерильные чашки Петри слоем 5-6 мм. Перед использованием чашки со средой подсушивают. Пример 2. Эффективность среды проверяли на тест-штаммах Listeria monocytogenes 766, Salmonella choleraesuis ATCC 13312, Escherichia coli 3912/41 (О55:K59), Proteus vulgaris HX 19 222, Staphylococcus aureus “Лоссманов”. Микробную взвесь каждого тест-штамма, приготовленного в стерильном 0,9% растворе натрия хлористого с концентрацией, соответствующей 10 единицам по стандартному образцу мутности, путем десятикратных разведений доводили до концентрации: Listeria monocytogenes 766 до разведения 10-7, S. choleraesuis ATCC 13312, Е. coli 3912/41 (055:K59), Р. vulgaris HX 19 222 до разведения 10-2, а S. aureus “Лоссманов” до разведения 10-5 м.к./мл. На чашку Петри со средой засевали по 0,1 мл микробной взвеси каждого тест-штамма из последних разведений. Посевы инкубировали при температуре 30oС в течение 48 ч. Учет результатов проводили визуально. Через 48 ч культивирования колонии L. monocytogenes 766 были круглые, серо-желтые, диаметром 0,2-1,0 мм, окруженные черной зоной; S. choleraesuis ATCC 13312, Е. coli 3912/41 (О55:K59), Р. vulgaris HX 19 222 – роста не было; S. aureus “Лоссманов” – круглые, лимонно-желтого цвета, диаметром 1,0-2,0 мм. Пример 3. Для приготовления питательной среды берут следующие навески компонентов, г/л: ПГРМ – 18,0 ПГК – 12,0 ЭПД – 2,5 Лития хлорид – 16,0 Натрия хлорид – 4,0 Эскулин – 0,9 Аммонийного железа цитрат (III) – 0,55 Полимиксина В сульфат – 0,015 Налидиксовая кислота – 0,025 Акрифлавин – 0,015 Агар-агар – 14,0 Дистиллированная вода – Остальное Приготовление и бактериологический контроль среды проводили в соответствии с примерами 1 и 2. Результаты контроля представлены в таблице. Пример 4. Для приготовления питательной среды берут следующие навески компонентов, г/л: ПГРМ – 15,0 ПГК – 10,0 ЭПД – 2,0 Лития хлорид – 15,0 Натрия хлорид – 3,5 Эскулин – 0,8 Аммонийного железа цитрат (III) – 0,5 Полимиксина В сульфат – 0,01 Налидиксовая кислота – 0,02 Акрифлавин – 0,01 Агар-агар – 13,0 Дистиллированная вода – Остальное Приготовление и бактериологический контроль среды проводили в соответствии с примерами 1 и 2. Результаты контроля представлены в таблице. Из таблицы видно, что предлагаемая среда обладает высокой селективностью, хорошими ростовыми свойствами по отношению к листериям и четкой дифференциацией от стафилококков. Нарушение количественного соотношения компонентов среды ведет к резкому ухудшению показателей качества предложенной среды и затрудняет выделение и дифференциацию листерий. Таким образом, по сравнению со средой-прототипом предлагаемая дифференциально-диагностическая среда для выделения листерий имеет ряд преимуществ: – не содержит дорогостоящих мясных переваров; – упрощается состав без ухудшения селективных и дифференцирующих свойств; – позволяет обеспечить производство среды без дополнительных материальных затрат, так как используются промышленно получаемые белковые основы. ИСТОЧНИКИ ИНФОРМАЦИИ, ПРИНЯТЫЕ ВО ВНИМАНИЕ 1. В.М. Котляров, И.А. Бакулов. Листериоз – нейроинфекция животных и людей. Материалы Международной научно-практической конференции 30-31 мая 2001. Покров, 2001, с.105. 2. Методические рекомендации по лабораторной диагностике листериоза животных и людей. М., 1987, с. 54. 3. RU 99123267 А, 20.09.2001. 4. RU 95109695 А, 10.10.1997. 5. Питательные среды. Каталог bio Merieux. 1996, с. 81-82. Формула изобретения Дифференциально-диагностическая среда для выделения листерий, содержащая источник азота, экстракт пекарных дрожжей, полимиксин, акрифлавин, эскулин, аммонийного железа цитрат (III), лития хлорид, натрия хлорид, агар-агар, отличающаяся тем, что, она дополнительно содержит налидиксовую кислоту и дистиллированную воду, а в качестве источника азота – панкреатический гидролизат рыбной муки и панкреатический гидролизат казеина, в качестве полимиксина – полимиксина В сульфат, при следующем соотношении компонентов, г/л дистиллированной воды: Панкреатический гидролизат рыбной муки 12,0-18,0 Панкреатический гидролизат казеина 8,0-12,0 Экстракт пекарных дрожжей 1,5-2,5 Лития хлорид 14,0-16,0 Натрия хлорид 3,0-4,0 Эскулин 0,7-0,9 Аммонийного железа цитрат (III) 0,45-0,55 Агар микробиологический 12,0-14,0 Полимиксина В сульфат 0,005-0,015 Налидиксовая кислота 0,015-0,025 Акрифлавин 0,005-0,015 РИСУНКИ
PC4A – Регистрация договора об уступке патента Российской Федерации на изобретение
(73) Патентообладатель(и):
(73) Патентообладатель:
Дата и номер государственной регистрации перехода исключительного права: 19.02.2007 № РД0018807
Извещение опубликовано: 27.03.2007 БИ: 09/2007
|
||||||||||||||||||||||||||
