Патент на изобретение №2150505

(54) СПОСОБ ВЫЯВЛЕНИЯ ВИРУСА ГЕПАТИТА С В СЫВОРОТКЕ КРОВИ ЧЕЛОВЕКА

(57) Реферат:

Изобретение относится к медицине и касается способа выявления вируса гепатита С в сыворотке крови человека. Сущность изобретения состоит в том, что подобраны универсальные праймеры, взятые из наиболее консервативного участка генома вируса гепатита С и амплифицирующие тот же район вирусной РНК, который в дальнейшем используется для определения генотипа вируса и позволяющие обнаруживать РНК всех известных к настоящему времени генотипов вируса. Преимущество способа заключается в сокращении двух стадий проведения анализа. 3 ил.

Изобретение относится к области медицины, а именно к созданию медицинских диагностикумов для определения наличия патогенных вирусов в крови человека. Нами разработан диагностикум для выявления вируса гепатита C в сыворотке крови на основе полимеразной цепной реакции.

На сегодняшний день известен ряд методов идентификации РНК вируса гепатита C (HCV) в сыворотке крови человека. Среди них – молекулярная гибридизация, полиморфизм длин рестрикционных фрагментов, прямой электрофоретический блоттинг (1, 2). У каждого из этих методов есть несомненные достоинства, но есть и существенные недостатки. А именно, техническая сложность, высокая стоимость в расчете на единичный анализ. Поэтому все более широкое распространение в мировой клинической практике получили методы на основе использования двухэтапной полимеразной цепной реакции (nested-PCR) (3.4). Самая удачная на наш взгляд модификация определения РНК HCV описана группой авторов во главе с Окамото X, и Накамурой Т. (Okamoto.H., Nakamura, Т.) в работе (5).

Методика, предложенная Окамото X. и Накамурой Т.

1.Выделение вирусной РНК.

К 150-ти мкл анализируемой сыворотки (заранее протестированной на наличие анти-HCV антител и давшей положительную реакцию) добавляют 150 мкл Трис-хлоридного буфера (50mM, pH 8.0; 150 mM NaCl; 10 mM ЭДТА). Смесь центрифугируют при 90000 об/мин 15 минут. Преципитаты суспендируют в Трис-хлоридном буфере (50mM, pH 8.0; 200 mM NaCl; 10 mM ЭДТА), добавляют 2% об/об додецилсульфата натрия и протеиназу К (1 мг/мл) и инкубируют при 60^oC 1 час. Затем нуклеиновые кислоты экстрагируют смесью фенол/хлороформ и высаживают этанолом.

2. Обнаружение 5′-некодирующих и кор-областей вируса полимеразной цепной реакцией (ПЦР).

Выделенные на стадии 1 РНК служат основой для синтеза к-ДНК с участием антисенс-праймера # 36 (5′-AAC ACT ACT CGG CTA GCA GT – 3) и обратной транскриптазы, при 70^oC, 1 мин. Дальнейшая амплификация к-ДНК проводится с использованием Gene Amp DNA Amplification Reagent (Perkin-Elmer Cetus). ПЦР проводится в 2 стадии на DNA Thermal Cycler (The Perkin Elmer Cetus). На первой стадии используются праймеры # 32A (CTG GAG GAA CTA CTG TCTT, сенс) и # 36 как антисенс а на второй – # 33 (TTC ACG CAG AAA GCG TCT AG, сенс) и # 48 (GTT GAT CCA AGA AAG GAC CC, антисенс). Режим реакции: денатурация при 94^oC – 1 мин, отжиг праймера при 55^oC 1.5 мин, синтез при 72^oC – 2 мин, количество циклов авторами не указано.

Авторы цитируемой работы использовали вышеприведенные пары универсальных праймеров только на промежуточном этапе и в дальнейшем рекомендовали несколько иную схему стадии 2, приводимую ниже при сохранении неизменной стадии 1.

2-а. Обнаружение вируса гепатита C в сочетании с типированием.

К-ДНК синтезирутся с использованием праймера # 186 (AYG TAC CCC AYG AGR TCG GC, здесь и далее символом Y обозначено наличие в данном положении либо T, либо C, a R- либо G, либо A). Режим реакции: денатурация при 94^oC – 1 мин, отжиг праймера при 55^oC – 1.5 мин, синтез при 72^oC – 2 мин, 35 циклов.

На первой стадии ПЦР амплифицируется участок длиной 272 нуклеотида с использованием праймеров # 256 (CGC GCG ACT AGG AAG ACT TC) и # 186 (AYG TAC CCC AYG AGR TCG GC), в режиме, указанном выше. По окончании реакции часть продукта (1/50) отбирается для участия во второй стадии, протекающей с участием универсального сенс-праймера # 104 (AGR AAR RCT TCS GAG CGR TC, S=G/C) набора типоспецифичных антисенс-праймеров. Продукты анализируются электрофоретически. На этой стадии мы не будем подробно оставливаться, так как определение серотипов гепатита C выходит за рамки предлагаемого изобретения.

Преимущества предлагаемого изобретения по сравнению с прототипом состоят в том, что подобранные нами универсальные праймеры взяты из наиболее консервативного участка генома вируса гепатита C и подобраны таким образом, что амплифицируется тот же район вирусной РНК, который в дальнейшем используется для определения генотипа вируса. Это позволяет достоверно и с высокой чувствительностью обнаруживать в сыворотке человеческой крови РНК всех известных к настоящему времени типов и подтипов вируса. Таким образом, использование предлагаемых нами праймеров при определении генотипа вируса гепатита C позволяет сократить две стадии по сравнению с прототипом. А именно – стадию обратной транскрипции и первую стадию полимеразной цепной реакции, так как определения генотипа с типоспецифическими праймерами можно сразу начать со второй стадии полимеразной цепной реакции, использовав в качестве исходного материала продукт амплификации первой стадии полимеразной цепной реакции с универсальными праймерами.

Описание предлагаемого способа обнаружения РНК вируса гепатита C.

В отличие от вышеописанной методики мы предлагаем внести некоторые изменения, начиная со стадии 2.

2. Обратная транскрипция и полимеразная цепная реакция N 1.

2.1 Реакционная смесь (конечные концентрации):
буфер (50 мМ хлористого калия, 10 мМ Трис, pH 8.3, 2 мМ
хлористого магния, 4% формамида),
нуклеотидтрифосфаты (250 мкМ)
дитиотреитол (5 мМ)
праймеры (по 2 мкМ)
ингибитор РНК-аз (5 ед/пробу)
Taq-полимераза (1 ед/пробу)
обратная транскриптаза (10 ед/пробу)
образец – количество РНК, эквивалентное выделенному из 10 мкл сыворотки)
2.2 Праймеры универсальные:
праймер для обратной транскрипции и антисенс-праймер для
ПЦР ASU1 5’AGG GTR TCG ATG AC 3′
сенс-праймер SU1 5′ GTG CTT GCG AGT GC 3′
R = G/A,
2.3 Режим реакции: обратная транскрипция 1 час при 42^oC
ПЦР: денатурация при 94^oC – 1 мин, отжиг праймеров при 42^oC – 1
мин, синтез при 72^oC – 1 мин, 35 циклов реакция протекает в программируемом термостате.

Продуктом этой стадии является фрагмент ДНК длиной 417 нуклетидов.

3.Полимеразная цепная реакция N 2.

3.1 Реакционная смесь (конечные концентрации):
буфер (50 мМ хлористого калия, 10 мМ Трис, pH 8.3, 2 мМ хлористого магния, 4% формамида)
нуклеотидтрифосфаты (250 мкМ)
праймеры (по 2 мкМ)
Taq-полимераза (1 ед/пробу)
образец-продукт ПЦР N 1-5 мкл
3.2 Праймеры универсальные:
сенс SU2 5′ GGA GGT CTC GTA GAC CGT G 3′
антисенс ASU2 5′ GGT RTC GAT GAC YTT ACC CA 3′ Y=T/C
3.3 Режим реакции: денатурация при 94^oC – 1 мин, отжиг праймеров при 58^oC – 1 мин, синтез при 72^oC – 1 мин, 20 циклов
Продуктом заключительной стадии 3 является фрагмент ДНК длиной 397 нуклетидов.

4. Анализ результатов. Продукты ПЦР N 2 анализируются электрофорезом в 2.5 % агарозном геле, содержащем бромистый этидий и визуализируются в УФ свете (фиг. 1 а,б).

Таким образом, предлагаемая нами методика отличается от прототипа составом праймеров и вытекающим из этого изменением условий реакции. Все это позволяет сократить трудоемкость, время выполнения и стоимость анализа без потери его чувствительности. Помимо этого сохраняется возможность на стадии 3 в качестве антисенс-праймеров использовать типоспецифические праймеры, предложенные в работе Окамото с сотр. (5) вместо предложенного нами антисенса или наряду с ним (см. фиг. 2) Это не только не снижает качество анализа, но и позволяет получить дополнительную информацию.

Ложноположительной реакции у здоровых ладей и больных гепатитом B не зафиксировано (см.фиг. 3).

Список литературы
1. Castelain. S., Khorshi. H., Zawadzki, P., Sueuer. J.M., Capron. J.P. Eb,F., Duverlie. G. J. Virol. Meth. 65(2):237-243 (1997);
2. Forns.X., Maluenda,M.D., Lopez-Labrador, F.X.,Ampurdanes, S., Olmedo, E. , Costa, J. , Simmonds, P., Sanches-Tapias, J.M., Jimenes De Anta.M.T., Rodes, J. Clin. Microbiol. 3(10):2516-2521 (1996):
3. Aslanzadeh. J, Padilla.B.B., Shanley, J.D. Moll. Cell. Probes 10(3): 173-178 (1996)
4. Okamoto, H., Kobata.S., Tokita, H., Inoue, T., Woodfeld, G.D., Holland, P. V. , Al-Khavy, B.A., Uzunalimoglu. O., Miyakava, Y., Mayumi.M. J. Virol. Meth. 57(1):31-45 (1996);
5.Okamoto.H., Nakamura, Т., Unated States Patent # 5.427.990, 1992б

Формула изобретения

Способ выявления вируса гепатита С в сыворотке крови человека на основе двухэтапной полимеразной цепной реакции, отличающийся тем, что используют следующие праймеры: SU1(5′-GTGCTTGCGAGTGC-3′), ASU1(5′-AGGGTRTCGATGAC-3′), SU2(5′-GGAGGTCTCGTAGACCGTG-3′) ASU2(5′-GGTRTCGATGACYTTACCCA-3)’, соответствующие наиболее консервативным участкам генома вируса гепатита С, позволяющие обнаруживать РНК всех известных к настоящему времени генотипов вируса и амплифицирующие тот же район вирусной РНК, который в дальнейшем используется для определения генотипа вируса.

РИСУНКИ

PC4A – Регистрация договора об уступке патента Российской Федерации на изобретение

Номер и год публикации бюллетеня: 33-2003

(73) Патентообладатель:

Судариков Андрей Борисович (RU)

Дата и номер государственной регистрации перехода исключительного права: 21.07.2003 № 17174

Извещение опубликовано: 27.11.2003