Патент на изобретение №2222591

(54) ШТАММ БАКТЕРИЙ ESCHERICHIA COLI № 2809:K 99, ИСПОЛЬЗУЕМЫЙ ДЛЯ ИЗГОТОВЛЕНИЯ ВАКЦИН И ДИАГНОСТИЧЕСКИХ ПРЕПАРАТОВ

(57) Реферат:

Изобретение относится к ветеринарной микробиологии. По серологическим свойствам штамм агглютинируется с сыворотками: “О”-коли 09 и антиадгезивной К 99. Штамм продуцирует термостабильный энтеротоксин. Вирулентность. ЛД₅₀ для белых мышей внутрибрюшинно 1,210⁸ живых микр.кл. Антигенная активность. При введении антигена в организм животного вырабатывается антитоксический и гуморальный иммунитет. Концентрация микробных клеток при выращивании штамма составляет 50-60 млрд. Штамм пригоден для изготовления колибактериозных вакцин, диагностикумов, для получения гипериммунных лечебных вывороток и глобулинов.

Предлагаемое изобретение относится к области ветеринарной микробиологии, в частности к получению штаммов для изготовления вакцин для профилактики колибактериоза (эшерихиоза) животных.

Колибактериоз (эшерихиоз), инфекционная болезнь, вызываемая энтеропатогенными эшерихиями, широко распространен во многих странах мира и наносит значительный экономический ущерб животноводству, складывающийся из высокой смертности молодняка (телят в первые дни жизни, а ягнят в послеотъемный период), снижения привесов, потери продуктивности у переболевших животных, поэтому актуальность проблемы борьбы с данным заболеванием – очевидна.

Известны штаммы эшерихий: Е. coli ВГНКИ 305-37/10, Е. coli ВГНКИ 355-37/12, Е. coli 288-37/9,Е. coli ВГНКИ 288-37/10, Е. coli ВГНКИ 328-37/11, Е. coli ВГНКИ 289-37/10, Е. coli ВГНКИ 297-37/10, Е. coli ВГНКИ 288/1-37/9, Е. coli ВГНКИ 58-37/2, Е. coli ВГНКИ 59-37/2, Е. coli ВГНКИ 299-37/10.

Штаммы эшерихий относятся к 13 серогруппам (08, 09, 015, 020, 026, 041, 055, 078, 086, 0101, 0115, 0117, 0119), которые ответственны за энзоотии колибактериоаза у телят и ягнят.

Штаммы обладают капсульными антигенами: К-99, К-43, К-14, К-30, К-60, К-61, К-62, К-69 и К-80, способны вырабатывать токсины и гемолизины.

Все указанные штаммы входят в “Вакцину против колибактериоза молодняка крупного рогатого скота и овец”.

Штаммы характеризуются следующими свойствами.

Морфологические свойства: штаммы представляют собой мелкие грамотрицательные палочки без спор и капсул. Размер 1,5-2 мкм, ширина 0,3-0,5 мкм. Клетки большинства штаммов подвижны за счет паретрихиально расположенных жгутиков.

Культуральные свойства: на МПБ все штаммы образуют помутнение через 6-8 час роста при 37-38^oС. На МПА образуют матовые, круглые, гладкие, мелкозернистые, слегка выпуклые колонии “S” формы диаметром 2-4 мм.

Ферментативные свойства: все штаммы сбраживают лактозу, глюкозу, маннит, арабинозу, ксилозу, сорбит, сахарозу (за исключением штамма 328-37/11, 58-37/2, 59-37/2, 297-37/10, 305-37/10, 289-37/10; рафинозу (за исключением штаммов 288-37/9, 289-37/10, 288/1-37/9); дульцит (за исключением штаммов 297-37/10 и 355-37/12).

Все штаммы образуют индол и свертывают молоко.

Штаммы 305-37/10, 288-37/9, 296-37/10, 67/37/2 обладают выраженными гемолитическими свойствами.

Антигенная структура: штаммы имеют следующую антигенную структуру: назовем штамм, который агглютинируется сывороткой К:99 – это штамм 328-37/11 агглютинируется сывороткой 0101 до 1: 6400 и сывороткой К:99 до титра 1:640.

Вирулентные свойства: величина ЛД₅₀ для белых мышей у штамма 328-37/11-380 млн.

Токсические и токсигенные свойства: штамм 328-37/11 – продуцирует термолабильный (ТЛ) токсин.

Все штаммы обладают эндотсксинами (1).

Известен также штамм Escherichia coli 454-37/11 в качестве продуцента адгезивного антигена К 99, представляющий собой филаментозное образование на поверхности бактериальных клеток.

Антиген К 99 представляет собой белок и состоит из субъединиц с мол.м. 18500-22500 дальтон. В лиофилизированном препарате содержится 93-94% белка, 4-5% липидов, 1-2% углеводов. Антиген К 99 термолабилен и денатурируется при 70^oС в течение 30 мин. Изоэлектрическая точка при рН 9,5.

Морфологические признаки. Штамм имеет палочковидную структуру с диаметром 8,4 нм и длиною до 130 нм с большой склонностью к агрегации.

Культуральные и ферментативные свойства. Аналогичны в ранее описанном штамме Escherichia coli 328-37/11.

Антигенная структура. Титр адгезивного антигена штамма E. coli 454-37/11 К:99 в РДП с МкАт или моноспецифической антиадгезивной К:99 сывороткой (титр 1:64) составляет (1:8)-(1:16).

Антигенная активность. Определяют в опытах на кроликах путем внутрибрюшинного введения антигена с последующим тестированием сывороткой в РА с моноплазмидным штаммом. Титр антител в сыворотке крови должен быть не ниже 1: 1280 (2).

В задачу наших исследований входило – получить штамм Escherichia coli с адгезивным антигеном К 99, обладающий высокой антигенной и иммуногенной активностью против колибактериозов (эшерихиозов).

Предложенный штамм Escherichia coli 2809:К 99 – возбудитель колибактериоза отнесен к семейству Enterobacteriaceae, к роду Escherichia coli, выделен в НИЛ инфекционной патологии и биотехнологии МГАВМ и Б из органов новорожденного теленка в 1988 г., колхоз им. 1 Мая, Щелковского района, Московской области.

Предложенный производственный штамм депонирован 27 апреля 2001 г., регистрационный номер – “штамм Escherichia coli 2809:К 99-МГАВМиБ-ДЕП” во Всероссийской государственной коллекции штаммов микроорганизмов, используемых в ветеринарии и животноводстве (123022, Россия, Москва, Звенигородское шоссе, д.5, ВГНКИ).

Местом хранения производственного штамма Escherichia coli 2809:К 99, возбудителя колибактериоза определена коллекция НИЛ инфекционной патологии и биотехнологии МГАВМиБ имени К.И.Скрябина (109472, Москва, ул.Ак.Скрябина), дублирующее хранение – НИЛ микробиологии МО РФ (610024, Россия, г. Киров, Октябрьский проспект 121, в/ч 23527).

Предложенный штамм Escherichia coli 2809: К 99 обладает следующими свойствами.

Антиген К 99 представляет собой белок, термолабилен.

Нуклеотидный состав ДНК (%ГЦ) 51,2, содержит плазмиды с MB 60 МДа и 6 МДа.

Морфологические, культуральные и ферментативные свойства: грамотрицательные, подвижные, полиморфные палочки, образуют полупрозрачные S-колонии через 18. ..24 час роста на плотной питательной среде при температуре 36… 38^oС.

Для повышения продукции гемолизинов и адгезинов используется среда “Минка”.

Ферментативная активность. Ферментирует глюкозу, лактозу, мальтозу, рамнозу, сахарозу, маннит, сорбит, не ферментирует инозит, образует индол, не образует сероводород, уреазу, ацетилметилкарбинол в реакции Фогес-Проскауэра.

Серологические свойства. Агглютинируется с сыворотками: “0”- коли 09, и антиадгезивной К 99 в реакции агглютинации на стекле.

Токсигенность. Штамм продуцирует термостабильный энтеротоксин.

Антигенная активность: при введении антигена животным вырабатывается антитоксический и гуморальный иммунитет.

Патогенные свойства: вирулентен для новорожденных телят, при пероральном заражении в дозе 10 млрд м.т. на 2-3 сутки вызывает проявление клинических признаков и на 5 сутки гибель животных.

Вирулентность: ЛД₅₀ для белых мышей внутрибрюшинно 1,210⁸ живых микр. кл.

Применяемый способ поддержания и хранения штамма: в лиофилизированном состоянии под вакуумом в герметично запаянных ампулах при температуре (-18). ..(-20)^oС после пассажа через организм белых мышей.

Периодичность пересева на питательных средах: 15-20 суток.

Условия транспортировки: в лиофилизированном состоянии под вакуумом в герметично запаянных ампулах.

Срок хранения: 10 лет.

Пример 1. Штамм бактерий Escherichia coli 2809: К 99 выращивают в реакторах при температуре 36-38^oС в казеиновом бульоне, при интенсивном механическом перемешивании и аэрации стерильным воздухом в течение 10-16 час. Концентрация микробных клеток составляет 50-60 млрд. м.к. по оптическому стандарту мутности ГИСК им. К.А. Тарасевича, что дало возможность применить штамм для изготовления инактивированной вакцины против колибактериоза (эшерихиоза) молодняка сельскохозяйственных животных и пушных зверей.

Вакцина, изготовленная с использованием предложенного штамма, обеспечивает защитный эффект от заражения вирулентными эпизоотическими штаммами после подкожной иммунизации через 5-7 суток.

Вакцина, изготовленная с применением в ней штамма E. coli 2809: К 99 апробирована с положительным результатом с 1995 по 2001 г. на территории России и стран СНГ: Беларусь, Кыргыстан, Узбекистан и др. на: 11550 головах стельных коров, 7290 супоросных свиноматок, 4270 овцематок, 2290 пушных зверей.

Сохранность поголовья составляет 96-99%.

Предложенный штамм может быть использован для производства биопрепаратов (вакцин, диагностикумов, а также для получения гипериммунных лечебных сыворток и глобулинов).

Источники информации
1. Патент РФ 1149467, кл. А 61 К 39/108, 1995.

2. Патент РФ 2043771, кл. А 61 К 39/108, 1995.3

Формула изобретения

Штамм бактерий Escherichia coli ВГНКИ № 2809:К99 МГАВМ и Б-ДЕП, используемый для изготовления вакцин и диагностических препаратов.

MM4A Досрочное прекращение действия патента Российской Федерации на изобретение из-за неуплаты в установленный срок пошлины за поддержание патента в силе

Дата прекращения действия патента: 30.11.2003

Извещение опубликовано: 20.05.2006 БИ: 14/2006