Патент на изобретение №2222015

(54) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ЦИТОКИНОВ И ИММУНОГЛОБУЛИНА Е В КОНДЕНСАТЕ ВЫДЫХАЕМОЙ ВЛАГИ

(57) Реферат:

Изобретение относится к медицине, а именно к биохимии и иммунологии. Способ концентрации конденсата выдыхаемой влаги (КВВ) до достижении порога чувствительности коммерческих наборов для иммуноферментного анализа включает лиофильное высушивание КВВ при комнатной температуре в течение 6 ч с последующим разведением забуференным физиологическим раствором в объеме, в 4-5 раз меньшем начального, и стабилизацию бычьим сывороточным альбумином до конечной концентрации 1%. Предложенный способ позволяет определить низкие концентрации иммунобиохимических маркеров в КВВ. 3 табл.

Изобретение относится к медицине, а именно к иммунологии, биохимии и пульмонологии, и может найти свое применение для лабораторной диагностики воспаления дыхательных путей различной этиологии.

Бронхолегочные заболевания остаются одними из наиболее актуальных проблем современной медицины.

Поиск способов оценки степени воспаления в дыхательных путях, его характера, оценки эффективности проводимой противовоспалительной и иммунотропной терапии является актуальной задачей пульмонологии.

Существует способ оценки местных факторов защиты бронхолегочной системы и биохимических маркеров воспаления в жидкости бронхоальвеолярного лаважа (БАЛЖ), который широко используется в пульмонологии для дифференциальной диагностики различных состояний. Забор БАЛЖ осуществляется специалистом с помощью бронхоскопа. После его забора производят центрифугирование полученного материала, в надосадочной жидкости определяют белки, гликопротеиды, иммуноглобулины, цитокины и другие вещества. Оценка иммунных и биохимических показателей БАЛЖ позволяет отдифференцировать различные заболевания бронхолегочной системы (бронхит, бронхиальная астма, туберкулез и др.), оценить степень выраженности воспаления и мониторировать его, контролировать эффективность проводимой терапии [3].

Однако при оценке БАЛЖ более информативна оценка ее клеточного состава, определение же биохимических маркеров в жидкой фазе имеет недостаточную достоверность из-за технических трудностей обеспечить одинаковое разведение БАЛЖ и возможность бактериальной контаминации.

К тому же забор БАЛЖ проводится специалистом-эндоскопистом, требует применения дорогостоящего оборудования, травматичен для пациентов. Степень комплаенса с пациентом при применении данного метода диагностики невысока. Существует целый ряд абсолютных и относительных противопоказаний для его забора (например, возраст ребенка, тяжесть состояния). Поэтому применять этот метод для мониторирования состояния пациента нецелесообразно.

Поэтому в пульмонологической клинике все большее развитие получают другие неинвазивные методы определения местных факторов иммунной защиты и биохимических маркеров воспаления, к которым относится исследование конденсата выдыхаемого воздуха (КВВ).

КВВ получают при свободном дыхании методом Г.И. Сидоренко и соавт. [4]. Сбор КВВ проводят в положении “сидя” после тщательного 5-кратного полоскания полости рта кипяченой водой. Объем получаемого КВВ составляет 5 мл, фиксируется время, затрачиваемое на его экспирацию (в среднем 10 минут). Это простой нетравматичный метод получения биологического материала от больного.

У пациентов, находящихся на искусственной вентиляции легких, забор КВВ производят из трубок дыхательного контура на выдохе. В конденсат выдыхаемого воздуха попадают те вещества, которые секретируются клетками эпителия дыхательных путей и ткани легкого.

В КВВ определяют наличие показателей перекисного окисления липидов, оксида азота, ₁-кислого гликопротеина [1]. Однако концентрация биологических веществ в КВВ недостаточна для определения других важных иммунобиохимических маркеров, например цитокинов или иммуноглобулина Е (IgE). А именно эти маркеры позволили бы на современном уровне изучить иммунологические механизмы воспаления нижних дыхательных путей и оценить степень выраженности воспаления и дифференцировать характер воспаления (неспецифическое и аллергическое) [2, 5].

Задача изобретения – разработать способ концентрации конденсата выдыхаемого воздуха для определения степени выраженности и характера воспаления, а также эффективности проводимой противовоспалительной терапии.

Заявленный технический результат достигается путем лиофильного высушивания при комнатной температуре в течение 6 часов с последующим разведением забуференным физиологическим раствором в объеме, в 4-5 раз меньшем начального объема КВВ. Для стабилизации полученного раствора добавляют бычий сывороточный альбумин (БСА) до конечной концентрации 1%, а цитокины и иммуноглобулин Е (IgE) определяют методом иммуноферментного анализа.

Ранее в доступной литературе нами не встречено работ по определению интерлейкинов (ИЛ) и иммуноглобулина Е в КВВ. Наши исследования показали присутствие ИЛ и IgE в небольших концентрациях, что свидетельствует о наличии механизмов их активной секреции клетками стенки верхних дыхательных путей и ткани легкого.

Предлагаемым способом было обследовано 120 больных, из них 76 детей и 44 взрослых пациентов, контролем служил КВВ, полученный от 50 практически здоровых человек (20 детей и 30 взрослых).

При исследовании КВВ, полученного по стандартной методике, ни у одного здорового человека нам не удалось обнаружить цитокинов или IgE. У больных нозокомиальной пневмонией в 3 случаях (15%) удалось выявить ИЛ-8 в количестве от 4,3 до 26 пг/мл, в других случаях (больные бронхиальной астмой, внебольничной пневмонией) выявить цитокины и IgE не удалось.

После концентрации КВВ путем лиофильного высушивания при комнатной температуре (18-24^oС) в течение 6 часов нами был проведен подбор разведений сухого вещества. Разведение производилось в объеме, в 2, 3, 4, 5, 6 раз меньшем начального объема (табл. 1).

В результате проведенных исследований установлено, что при разведении КВВ в объеме, меньшем в 4 и более раз, во всех исследуемых нами пробах удалось выявить содержание тестируемых цитокинов. Однако объем материала, полученного при разведении в 6 раз и меньше, недостаточен для исследований (при разведении, в 6 раз меньшем начального объема, мы получаем только 0,8 мл биологической жидкости и с учетом потерь можно исследовать не более 3-4 маркеров). Поэтому оптимальным считаем разведение объемом, в 4-5 раз меньшим начального объема.

После концентрации КВВ по предлагаемому нами способу во всех исследованных пробах нами определено содержание цитокинов (ИЛ-2, ИЛ-4, ИЛ-8). Иммуноглобулин Е определен у всех пациентов (детей и взрослых) с бронхиальной астмой, у некоторых больных с пневмонией и у лиц контрольной группы (табл. 2).

Как видно из таблицы, IgE определялся у всех больных бронхиальной астмой и его уровень был существенно выше, чем у больных пневмониями и здоровых лиц. Уровень ИЛ-2 в КВВ был повышен у обследуемых больных по сравнению с контрольной группой, однако не зависел от патогенетических особенностей воспалительного процесса. Уровень ИЛ-4 был существенно выше у больных по сравнению с показателями контроля, при этом у пациентов с бронхиальной астмой содержание ИЛ-4 превышало его уровень у больных с пневмонией, что свидетельствует о превалировании Th2 процессов при бронхиальной астме. Уровень ИЛ-8, напротив, был существенно выше (в десятки раз) у больных с пневмонией, что отражает особенности воспалительного процесса в легких.

Таким образом, определение IgE и цитокинов ИЛ-4 и ИЛ-8 и анализ их уровня позволяет проводить дифференциальную диагностику аллергического и неспецифического воспаления в бронхоальвеолярной системе. Повышение IgE и ИЛ-4 свидетельствует об аллергическом воспалении, тогда как существенное нарастание ИЛ-8 – о неспецифическом характере воспалительного процесса.

Нами оценена возможность использования предлагаемого способа для определения степени выраженности воспаления в дыхательных путях.

Мы проанализировали уровень цитокинов в КВВ у больных пневмонией разной степени тяжести: среднетяжелой и тяжелой (табл.3).

В результате проведенных исследований установлено, что у больных пневмонией тяжелого течения существенно возрастает уровень ИЛ-8 и регистрируется снижение ИЛ-2.

Таким образом, исследование цитокинов в КВВ позволяет определить степень выраженности воспаления в дыхательных путях.

Таким образом, в результате проведенных нами исследований получено, что концентрация КВВ с последующим разведением, в 4-5 раза меньшим его начального объема, и стабилизация его состава 1% БСА являются наиболее оптимальными для определения низких концентраций иммунобиохимических маркеров воспаления с использованием коммерческих наборов для иммуноферментного анализа.

Пример 1. Больной А., 42 лет. Диагноз: Нозокомиальная пневмония. Тяжелое течение. Разлитой перитонит. Поступил в краевую клиническую больницу 18.01.02 г. в отделение экстренной хирургии, прооперирован 18.01.02 г. по поводу перфоративной язвы желудка, переведен в отделение реанимации и интенсивной терапии. При поступлении в ОРИТ состояние больного крайне тяжелое, кожные покровы бледные, заторможен, проводится искусственная вентиляция легких, чсс – 100 уд/мин, АД 100/70 мм рт.ст. Клинический анализ крови при поступлении в ОРИТ Нb – 80 г/л; Еr – 2,610¹²/л, L – 12,710⁹/л, СОЭ – 34 мм/ч, э – 0, п – 9, с – 46, л – 33, м – 12, токсическая зернистость нейтрофилов. В КВВ метаболиты оксида азота – 86,6 ммоль/л; ИЛ-2 – 28,0 пг/мл; ИЛ-4 – 16,4 пг/мл; ИЛ-8 – 346,3 – пг/мл; IgE – 0.

При проведении комплексной интенсивной терапии: состояние улучшилось, 23.01.02 г. экстубирован. Состояние тяжелое, сознание ясное, чд – 24 в мин, чсс – 90 уд./мин. Клинический анализ крови: Нb – 100 г/л, Еr – 3,310¹²/л, L – 10,010⁹/л, СОЭ – 20 мм/ч, э – 0, п – 3, с – 59, л – 29, м – 9. В КВВ метаболиты оксида азота – 40,0 ммоль/л; ИЛ-2 – 46 пг/мл; ИЛ-4 – 18,6 пг/мл; ИЛ-8 – 106,34 пг/мл; IgE – 0.

Таким образом, при поступлении в ОРИТ в КВВ больного регистрировалось резкое увеличение ИЛ-8 при достаточно низком уровне ИЛ-4 и отсутствии Ig E, что свидетельствует о воспалительном процессе бактериального происхождения. В динамике болезни (5 сутки) при улучшении состояния больного уровень ИЛ-8 снизился в 3 раза.

Таким образом, определение цитокинов и Ig E в конденсате выдыхаемой влаги адекватно отражают характер и степень выраженности воспаления в ткани легких.

Пример 2. Больной Г. 11 лет. Диагноз: Бронхиальная астма, средней степени тяжести, приступный период, ДН I. Аллергический ринит, персисстирующий, среднетяжелый.

Обратился с жалобами на одышку с затрудненным выдохом, сильный приступообразный сухой кашель, усиливающийся при контакте с холодным воздухом, резкими запахами, табачным дымом, заложенность носа.

Объективно: состояние средней тяжести. Бледность кожных покровов. ЧД 22/мин, пульс 120/мин слабого наполнения и напряжения. ПСВ 330/мин. В легких аускультативно над всей поверхностью рассеянные сухие хрипы. Живот мягкий, безболезненный. Стул – диурез в норме.

Исследование функции внешнего дыхания: обструкция дыхательных путей на уровне средних и мелких бронхов. Проба с сальбутамолом положительная 20%. Риноманометрия: обструкция носовых ходов.

Клинический анализ крови: НВ 134 г/л, эритроциты 4,310¹²/л, лейкоциты 6,310⁹/л, эозинофилы 9%, нейтрофилы палочкоядерные 2%, сегментоядерные 56%, лимфоциты 30%, моноциты 3%. Общий сывороточный IgE 700 МЕ/мл. Цитология назального секрета – эозинофилы 8%, нейтрофилы 90%, моноциты 2%. КВВ: метаболиты оксида азота 41,64 ммоль/л, общий IgE 70 МЕ/мл, ИЛ-2 – 69,12 пг/мл, ИЛ-4 – 18,62 пг/мл, ИЛ-8 – 3,48 пг/мл.

Проведено лечение: раствор беродуала через небулайзер 1 мл 3 раза в день (3 дня), лейкинферон 10000 ME через небулайзер 1 раз в день (3 дня). Доз. аэрозоль флутиказона дипропионата 250 мг/сутки ингаляционно (1 месяц). Доз. аэрозоль беродуала 1 доза 4 раза в день (5 дней). Состояние улучшилось. После ингаляции 1 мл раствора беродуала ПСВ 380/мин. В легких – единичные сухие хрипы на высоте выдоха. На 4 день состояние стабилизировалось. ПСВ 380-400/мин. На 8 день потребности в бронхолитических препаратах нет. Больной продолжает получать базисную терапию флутиказоном дипропионатом. При исследовании функции внешнего дыхания отмечается незначительная обструкция дыхательных путей на уровне средних и мелких бронхов. Проба с сальбутамолом отрицательная. Клинический анализ крови: НВ 137 г/л, эритроциты 4,5l0¹²/л, лейкоциты 6,610¹²/л, эозинофилы 4%, нейтрофилы палочкоядерные 2%, сегментоядерные 56%, лимфоциты 33%, моноциты 5%. Общий сывороточный IgE 180 МЕ/мл. Цитология назального секрета: эозинофилы 4%, нейтрофилы 90%, моноциты 6%. КВВ: метаболиты оксида азота 6,8 ммоль/л, общий IgE 34 МЕ/мл, ИЛ-2 – 37,79 пг/мл, ИЛ-4 – 2,72 пг/мл, ИЛ-8 – 3,02 пг/мл.

Как показано, определение цитокинов и IgE в КВВ до и после лечения отражает эффективность базисной противоспалительной терапии.

Таким образом, предлагаемый способ определения цитокинов и IgE в конденсате выдыхаемой влаги позволяет оценить степень активности и характер воспаления, а также мониторировать эффективность проводимой антимикробной и противоспалительной терапии.

Литература

2. Ковальчук Л.В., Ганковская Л.В., Рубакова Э.И. Система цитокинов. – М.: РГМУ, 1999, 74 с.

3. Мотавкин П.А., Гельцер Б.И. Клиническая и экспериментальная патофизиология легких. М.: Наука, 1998. – 336 с.

Формула изобретения

Способ определения цитокинов и иммуноглобулина Е в конденсате выдыхаемой влаги, включающий забор конденсата выдыхаемого воздуха и его лабораторные исследования, отличающийся тем, что конденсат выдыхаемой влаги концентрируют путем лиофильной сушки при комнатной температуре в течении 6 ч с последующим разведением забуференным физиологическим раствором в объеме в 4-5 раз меньшим начального объема конденсата выдыхаемой влаги, стабилизируют бычьим сывороточным альбумином до конечной концентрации 1%, а цитокины и IgЕ определяют методом иммуноферментного анализа.

РИСУНКИ