Патент на изобретение №2221864

(54) ШТАММ БАКТЕРИЙ KLEBSIELLA PNEUMONIAE, ДЕПОНИРОВАННЫЙ В ВГНКИ ПОД № 23 МГАВМИБ-ДЕП, ДЛЯ ПРОИЗВОДСТВА ВАКЦИНЫ ПРОТИВ КЛЕБСИЕЛЛЕЗА МОЛОДНЯКА СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННЫХ ЖИВОТНЫХ

(57) Реферат:

Изобретение относится к области ветеринарной микробиологии. Предложен новый штамм бактерий Klebsiella pneumoniae, который депонирован в ВГНКИ под 23 МГАВМиБ-ДЕП. Предложенный штамм был выделен в НИЛ инфекционной патологии и биотехнологии МГАВМиБ из фекалий новорожденного теленка в 1987 году. Штамм является продуцентом – и -гемолизинов. Новый штамм характеризуется высокой урожайностью – 50-60 млрд. клеток в 1 мл по оптическому стандарту мутности ГИСК им. К. А. Тарасевича. Предложенный штамм может быть использован в ветеринарии для производства вакцин против клебсиеллеза молодняка сельскохозяйственных животных, а также для получения иммунных препаратов для профилактики и лечения острых кишечных заболеваний животных.

Изобретение относится к области ветеринарной микробиологии и биотехнологии, в частности к получению штаммов Klebsiella pneumoniae для получения вакцин против клебсиеллеза и иммунных препаратов для профилактики кишечных заболеваний сельскохозяйственных животных.

В настоящее время особое внимание уделяют диагностике малоизученных инфекционных заболеваний, характеризующихся тяжелым течением, а нередко и летальным исходом. К их числу относятся клебсиеллезные инфекции, которые обычно не распознаются и проходят под другими диагнозами. Клебсиеллы обнаруживаются при пневмонии, инфекциях мочеполовой системы, острых желудочно-кишечных заболеваниях, различных гнойно-септических осложнениях, а также при внутрибольничных инфекциях, менингите, глазных инфекциях, анкилозирующем спондилите, полиартрите и др.

Клебсиеллы вызывают интерес у специалистов ветеринарной службы, ботаников и гигиенистов, так как их обнаруживают и при заболеваниях животных (пневмонии, маститы, септицемии), выделяют из пищевых продуктов, с поверхности овощей и семян, цветов, из воды различных водоемов. Такое повсеместное распространение клебсиелл свидетельствует о значении этой проблемы не только для медицины, но и для народного хозяйства (1).

Известен штамм бактерий Klebsiella pneumoniae ГИСК 233, используемый как референс-штамм при определении гемолизинов энтеробактерий. Штамм выделен из клинического материала больного ОКИ.

Штамм бактерий Klebsiella pneumoniae ГИСК 233 характеризуется следующими свойствами:
Морфологические признаки. Грамотрицательные короткие палочки, неподвижные, жгутиков и спор не образует. При окраске выявлена капсула, диаметр которой составляет 1/2 диаметра тела бактериальной клетки.

Культуральные свойства. На МПБ через 3 ч дает легкое гомогенное помутнение, через 18-24 ч – диффузный рост с выраженными муаровыми волнами.

На МПА: светлые, полупрозрачные колонии с ровными гладкими краями, легко снимаются, диаметр 1,0-1,5 мм, признаков диссоциации нет. На среде Эндо: колонии бледно-розового цвета с более яркой точкой в центре при просмотре на свет, куполообразные, маслянистые, диаметр колоний 1,5-2,0 мм. Признаков диссоциации нет. На среде К₂: светлые полупрозрачные колонии с легким желтоватым оттенком, маслянистые, диаметр колоний 1,0-1,5 мм. Признаков диссоциации нет.

Физико-биологические свойства. Оптимум температурного роста (371)^oС; рН среды 7,0-7,2. Оптимальные условия аэробные. Активно расщепляет глюкозу и глицерин с образованием кислоты и газа, а также маннит, сахарозу, мальтозу, арабинозу, адонит, инозит, дульцит, ксилозу, сорбит, рамнозу, замедленно лактозу. Декарбоксилирует лизин, утилизирует малонат натрия и цитрат Козара, а также Симонса, обладает замедленной уреазной активностью, дает положительную реакцию Фогес-Проскауэра, т.е. ферментирует глюкозу с образованием ацетил метилкарбинола (ацетоина). Не образует сероводород и индол, в реакции метил-рот отрицательна. Орнигиндекарбоксилаза, эргининдегидролаза и фенилаланиндезаминаза отсутствует. Штамм неподвижен.

Антигенная структура штамма при серотипировании набором сывороток ЦНИИВиС им. Мечникова не установлена.

Чувствительность к антибактериальным препаратам. Исследованиями методом серийных разведений установлена чувствительность к следующим антибиотикам: неомицину (10 мг/мл), канамицину (5 мкг/мл), гентамицину 82,5 (мкг/мл), сизомицину (1 мкг/мл), кефзолу (5 мкг/мл), клафорану (25 мкг/мл), левомицетину (10 мкг/мм), полимиукину В (5 мкг/мл), налидиксовой кислоте (10 мкг/мм). Устойчив к бензилпенициллину (10 мкг/мм), ампициллину (1,5 мкг/мм), ампиоксу (1,5 мкг/мм), тетрациклину (50 мкг/мм), эритромицину (250 мкг/мм).

Биологические свойства. Штамм обладает способностью стабильно продуцировать – и -гемолизины.

Вирулентные свойства. ЛД₅₀ для белых мышей 2 х 10⁹ м.т. (2).

Известен также штамм бактерий Klebsiella pneumoniae 140, обладающий комплексом факторов патогенности, имеющий регистрационный 245, штамм выделен от больного ребенка с кишечной инфекцией.

Штамм Klebsiella pneumoniae ГИСК 245 характеризуется следующими свойствами:
Морфологические признаки. При окраске по Граму – грамотрицательные палочки располагаются в мазке отдельно или попарно.

Культуральные свойства. При выращивании на 1,5%-ном МПА (рН 7,2) при температуре 35-37^oС штамм растет с образованием мутных слизистых, различных по структуре колоний. При выращивании в бульоне Хоттингера (рН 7,2) температура 33-36^oС в течение 20 ч дает интенсивное помутнение.

Способы определения активности ЛТ-энтеротоксина:
– субпланарное введение мышам весом 15-16 г 0,05 мл центрифугата 20-часовой бульонной культуры вызывает отек лапки не менее 90 мг (Аксенова Е.В. 1980 г.);
– интраназальное введение 0,05 мг 20-часовой бульонной культуры вызывает гибель 95% мышей-самцов весом 15-16 г в течение 18 мин при явлениях тонических судорог и асфиксии;
– внутримышечное введение 300 млн. микробных клеток 20-часовой бульонной культуры вызывает некроз кожи кролика диаметром 3,5 см;
– в опыте петля тонкой кишки кролика при введении 500 млн. м. т. 20-часовой бульонной культуры дает положительный результата (у/1=1,2);
– гретый при 56^oС в течение 45 мин центрифугат 20-часовой бульонной культуры вызывает отек лапки мышей до 30 мг, не вызывает некроза кожи кролика. Гретая при 100^oС 20-часовая бульонная культура не вызывает накопления жидкости в изолированной петле тонкого кишечника кролика (у/1=0,3).

Условия хранения культуры после леофильной сушки при выращенной в 0,3%-ном МПА (рН 7,2-7,4), залитым стерильным вазелиновым маслом, при температуре 4^oС.

Среды для размножения – бульон Хоттингера (рН 7,2-7,4), содержащий 5% эритроцитов кролика при 35-36^oС в течение 20 ч.

Генетические особенности. Устойчив к ампициллину, эритромицину, оксациллину, метициллину, карбенициллину, тетрациклину, стрептомицину (3).

В задачу наших исследований входило получить штамм Klebsiella pneumoniae, пригодный для получения иммунных препаратов для профилактики и лечения клебсиеллеза сельскохозяйственных животных.

Предложенный штамм Klebsiella pneumoniae 23 – возбудитель клебсиеллеза – отнесен к семейству Enterobacteriaceae к роду Klebsiella, выделен в НИЛ инфекционной патологии и биотехнологии МГАВМиБ из фекалий новорожденного теленка, колхоза имени В.И.Ленина, Тульской обл., в 1987 г.

Предложенный производственный штамм Klebsiella pneumoniae 23 депонирован 27 апреля 2001 г., регистрационный номер – “штамм Klebsiella pneumoniae 23 МГАВМиБ – ДЕП”, во Всероссийской государственной коллекции штаммов микроорганизмов, используемых в ветеринарии и животноводстве (123022, Россия, Москва, Звенигородское шоссе, 5, ВГНКИ).

Местом хранения производственного штамма Klebsiella pneumoniae 23 – возбудителя клебсиеллеза – определена коллекция НИЛ инфекционной патологии и биотехнологии МГАВМиБ им. К.И.Скрябина, 109472, Москва, ул. Ак.Скрябина, 23, дублирующее хранение НИИ микробиологии МО РФ (610024, Россия, г. Киров, Октябрьский пр.. 121, в/ч 23727).

Предложенный производственный штамм Klebsiella pneumoniae 23 обладает следующими свойствами:
Морфологические признаки: Грамотрицательные короткие палочки, не образует спор, при окраске по Бурри установлено наличие капсул, не имеет жгутиков, неподвижен.

Культуральные свойства. На МПБ через 5-6 ч наблюдается равномерное помутнение среды с образованием поверхностной пленки. На среде Эндо образует красные колонии, на Плоскиреве розовые колонии с желтоватым центром.

На МПА – полупрозрачные колонии слизистой консистенции. На 5%-ном кровяном агаре образует зоны лизиса.

Признаки диссоциации не наблюдаются.

Ферментативные свойства. Активно расщепляет глюкозу и глицерин с образованием кислоты и газа, а также сахарозу, лактозу, рамнозу, мальтозу, сорбит, маннит, инозит, не образует индол, сероводород, образует ацетилметилкарбинол в реакции Фогес-Проскауэра.

Антигенная структура. Штамм серотипирован набором клебсиеллезных К-сывороток НИИВС им. Мечникова как Klebsiella pneumoniae К 8.

Генетические признаки.

Чувствительность к антибиотикам.

По результатам исследования методом стандартных дисков штамм чувствителен к левомицитину, гентамицину, пефлоксацину и цифазамину.

Устойчив: к бензилпенициллину, эритромицину, стрептомицину, рокситромицину, клоритромицину.

Нуклеотидный состав. ДНК (% ГЦ) – 56,8.

Содержит плазмиду с м.в. 60 МД.

Штамм является продуцентом и -гемолизинов.

Патогенные свойства. Вирулентен для белых мышей. ЛД₅₀ при внутрибрюшинном введении составляет 3,1 х 10⁸ живых микроклеток.

При пероральном заражении новорожденных телят через 10…..18 ч у животных наблюдали клинические признаки заболевания желудочно-кишечного тракта, что указывает на эпизоотическую значимость штамма Klebsiella pneumoniae 23 в развитии клинической картины острых кишечных заболеваний. При заражении в ассоциации с другими энтеропатогенными штаммами вызывала гибель животных на 5-6 сутки.

Периодичность пересева на питательных средах 15-20 суток.

Применяемый способ хранения и поддержания штамма. В лиофилизированном состоянии под вакуумом в герметично запаянных ампулах при минус 18…..20^oС после пассажа через организм белых мышей.

Условия транспортировки. В лиофилизированном состоянии под вакуумом в герметично запаянных ампулах.

Срок хранения. 10 лет.

Пример. Штамм Klebsiella pneumoniae 23 находится в лиофилизированном состоянии. Для культивирования ампулу вскрывают в асептических условиях, разводят МПБ и подращивают в течение 4 ч при 37^oС, затем переносят в 20-литровую бутыль с МПБ и выращивают при температуре 36-38^oС в течение 18-20 ч при аэрации стерильным воздухом в количестве 4-5 объема воздуха на объем среды в минуту. При глубинном культивировании микробную культуру, соблюдая требования стерильности, перекачивают в реактор на казеиновый бульон. Плотность посева составляет 100-300 млн. микроклеток на 1 см³.

Культивирование проводят при 37-38^oС при интенсивном перемешивании и аэрации стерильным воздухом из расчета объем стерильного воздуха на объем среды (1:2).

В процессе выращивания проводят корректировку рН среды в пределах 7,6-8,0 ед. рН.

Урожайность штамма в среднем составляет 50-60 млрд. микр. клеток в 1 мл по оптическому стандарту мутности ГИСК им. К.А.Тарасевича, что дало возможность использования штамма Klebsiella pneumoniae 23 в качестве антигена в инактивированной вакцине и обеспечило создание активного иммунитета против клебсиеллеза у молодняка сельскохозяйственных животных.

Вакцина из производственного штамма Klebsiella pneumoniae 23 апробирована с положительным результатом с 1995 по 2001 гг. на территории России и стран СНГ: Беларусь, Кыргыстан, Узбекистан и др. на 11550 голов стельных коров, 7290 супоросных свиноматок, 4270 овцематок, 2290 пушных зверей. Сохранность поголовья составляет 96-99%.

Предложенный штамм может быть использован при получении иммунных препаратов для профилактики и лечении острых кишечных заболеваний животных.

Источники информации
1. Кн. В. Н.Красноловеда и Б.С.Киселева “Клебсиеллезные инфекции”, М., Медицина, 1996 г., с.3.

2. Патент РФ 2081168, 1997 г., кл. С 12 N 1/20.

3. Патент РФ 2105809, 1998 г., кл. С 12 N 1/20.

Формула изобретения

Штамм бактерий Klebsiella pneumoniae, депонированный в ВГНКИ под № 23 МГАВМиБ-ДЕП для производства вакцины против клебсиеллеза молодняка сельскохозяйственных животных.

MM4A Досрочное прекращение действия патента Российской Федерации на изобретение из-за неуплаты в установленный срок пошлины за поддержание патента в силе

Дата прекращения действия патента: 08.02.2004

Извещение опубликовано: 10.10.2005 БИ: 28/2005