Патент на изобретение №2221040

(54) ШТАММ “ВНИИЗЖ” ВИРУСА ИНФЕКЦИОННОГО РИНОТРАХЕИТА КРУПНОГО РОГАТОГО СКОТА ДЛЯ ИЗГОТОВЛЕНИЯ ВАКЦИННЫХ И ДИАГНОСТИЧЕСКИХ ПРЕПАРАТОВ

(57) Реферат:

Изобретение относится к ветеринарной вирусологии и биотехнологии. Штамм депонирован в коллекции штаммов микроорганизмов ВГНКИ под шифром “ВНИИЗЖ-ДЕП”. Штамм обладает высокой биологической, антигенной и иммуногенной активностью и пригоден для изготовления эффективных вакцинных и диагностических препаратов. 8 табл.

Изобретение относится к области ветеринарной вирусологии и биотехнологии и может быть использовано при изготовлении средств специфической профилактики и диагностики инфекционного ринотрахеита (ИРТ) крупного рогатого скота (КРС).

ИРТ – остропротекающая контагиозная болезнь КРС вирусной этиологии, наносящая значительный экономический ущерб скотоводству.

Вирус ИРТ вызывает заболевание КРС различных возрастных групп, проявляющееся пятью формами: поражением верхних дыхательных путей, вагинитами, энцефалитами, конъюктивитами и артритами. Кроме того, у телят возможна пневмония.

Болезнь широко распространена во всем мире. В США в 1954-1956 гг. она протекала как эпизоотия с большим экономическим ущербом. Частые случаи ИРТ отмечены в Канаде, Южной Африке, Новой Зеландии, Австралии, Англии, Германии, Франции, Швеции, Швейцарии, Австрии, Италии, Румынии и других странах. В нашей стране ИРТ был впервые диагностирован в 1968 г. и подтвержден вирусологически в 1969 г. в связи с ввозом различных пород КРС из некоторых вышеуказанных стран, неблагополучных по данной инфекции.

Экономический ущерб, наносимый ИРТ, слагается из снижения удоев в период болезни (до 50-60%), значительного увеличения сервис-периода и яловости коров, болевших вагинальной формой, слабого развития больного молодняка и значительным процентом гибели и выбраковки телят. При хронической серозно-гнойной пневмонии погибает до 20% молодняка.

Вакцинопрофилактика ИРТ занимает ведущее место в комплексе противоэпизоотических мер, направленных на борьбу с этим заболеванием. Для профилактики ИРТ применяют как живые, так и инактивированные вакцины, полученные из вируса, репродуцированного в различных культурах клеток (1, 2, 3).

Известен штамм “ТК-А(ВИЭВ)-2” вируса ИРТ КРС, используемый для изготовления живой вакцины (4).

Известен штамм 4016 вируса ИРТ КРС, используемый для изготовления инактивированной вакцины (5).

Известен штамм “ТК-А (ВИЭВ)-В2” вируса ИРТ КРС, используемый для изготовления инактивированной вакцины (6).

Известен штамм Herpesvirus bovis 1 “Щапово” вируса ИРТ КРС, используемый для изготовления инактивированной вакцины (7).

Известен штамм ТК-А вируса ИРТ КРС, используемый для изготовления инактивированной вакцины (8).

За рубежом известен также ряд штаммов вируса ИРТ КРС, используемых для производства вакцинных препаратов (9, 10, 11).

Общим недостатком известных штаммов является низкая противоэпизоотическая эффективность изготовленных на их основе вакцинных препаратов. В связи с этим задача отбора и изучения эпизоотических изолятов данного возбудителя в целях получения новых производственных штаммов ИРТ для изготовления вакцинных препаратов остается актуальной.

В задачу создания настоящего изобретения входило получить новый производственный штамм вируса ИРТ КРС, обладающий высокой биологической, антигенной и иммуногенной активностью, сохраняющий свои нативные иммунобиологические свойства после инактивации и пригодный для изготовления высокоиммуногенных вакцинных препаратов, способных защитить поголовье КРС от эпизоотического возбудителя ИРТ КРС, циркулирующего на территории Российской Федерации.

Технический результат от использования предлагаемого изобретения заключается в расширении арсенала штаммов вируса ИРТ КРС, обладающих высокой биологической, антигенной и иммуногенной активностью, сохраняющих свои нативные иммунобиологические свойства после инактивации и пригодных для изготовления высокоэффективных вакцинных препаратов.

Указанный технический результат достигнут получением штамма “ВНИИЗЖ” вируса ИРТ. Штамм “ВНИИЗЖ” является новым, ранее неизвестным. Исходный вирус для получения штамма “ВНИИЗЖ” выделен из патологического материала телят, павших с явлениями ИРТ во время вспышки заболевания в СПК “Миневское” Нижегородской области в 1998 году. Производственный штамм “ВНИИЗЖ” вируса ИРТ получен путем многократных последовательных пассажей на чувствительных биологических системах.

Полученный штамм депонирован во Всероссийской государственной коллекции штаммов микроорганизмов, используемых в ветеринарии и животноводстве, Всероссийского научно-исследовательского института контроля, стандартизации и сертификации ветеринарных препаратов (ВГНКИ) МСХ РФ 12 марта 2001 года под регистрационным шифром “ВНИИЗЖ-ДЕП”.

Штамм “ВНИИЗЖ” вируса ИРТ обладает высокой биологической, антигенной и иммуногенной активностью в нативном виде и после инактивации. Экспериментально подтверждена его возможность использования для приготовления инактивированной вакцины против ИРТ КРС. Штамм “ВНИИЗЖ” обеспечивает получение инактивированной вакцины против ИРТ, создающей эффективную защиту КРС против указанного возбудителя заболевания.

Штамм “ВНИИЗЖ” вируса ИРТ характеризуется следующими признаками и свойствами.

Морфологические свойства.

Штамм “ВНИИЗЖ” вируса ИРТ относится к семейству Herpesviridae, подсемейству Alphaherpesvirinae, роду Varicellavirus, группе HPV-1, обладает морфологическими признаками, характерными для данного семейства.

Штамм “ВНИИЗЖ” состоит из линейной 2-нитчатой ДНК с молекулярной массой 92-102 кД, вирионы – частицы округлой формы, состоят из 4-х структурных компонентов: нуклеотида, капсида диаметром 120-150 нм, окруженного содержащей липиды оболочкой, мембраны (тегумента) и наружной оболочки. Плавучая плотность вирионов в градиенте CsCL 1,27-1,29 г/см³. Нуклеотид тороидальной формы содержит ДНК и окружен икосаэдрическим капсидом диаметром 100-110 нм, содержащим 162 частично полых капсомера. Капсид окружает ядро вириона, состоящее из ДНК, покрытой белком. Мембрана из глобулярного материала окружает капсид. В составе вириона определено до 32 белков с молекулярной массой до 290 кД. Вирионы имеют сложную организацию, включая не менее 4 компонентов: core, капсид, суперкапсидную структуру и оболочку. Наружная оболочка вирионов имеет типичное строение и содержит многочисленные выступы (шипы) длиной около 8 нм. Вирусы формируют характерные внутриядерные включения. Вирионы при прохождении через внутренний листок ядерной мембраны в эндоплазматический ретикулум покрываются дополнительной оболочкой, содержащей гликопротеины и липиды.

Антигенные свойства.

По своим антигенным свойствам штамм “ВНИИЗЖ” относится к группе 1 герпесвирусов КРС. Вирус стабильно нейтрализуется гомологичной антисывороткой. Вирус обладает гемагглютинирующей активностью (ГА-активностью), реагируя с антителами переболевших или иммунизированных животных в реакции непрямой гемагглютинации (РНГА). При вакцинации лабораторных и естественно-восприимчивых животных вирусный антиген индуцирует образование специфических антител, выявляемых в РНГА в разведении 1:16-1:256.

Биотехнологические характеристики.

Штамм “ВНИИЗЖ” является вирулентным и обладает высокой биологической активностью в нативном виде, а также проявляет высокие антигенные и иммуногенные свойства после инактивации.

Штамм “ВНИИЗЖ” предназначен для изготовления инактивированной вакцины против ИРТ КРС. Штамм “ВНИИЗЖ” репродуцируется в культурах клеток ВНК, МДВК, 3КГ, вызывая цитопатическое действие (ЦПД), и в течение 48-96 часов инкубирования накапливается в титре 6,5-8,0 lg ТЦД₅₀/см³. Штамм “ВНИИЗЖ” является стабильным и сохраняет свои свойства на протяжении 10 пассажей (срок наблюдения).

Хемо- и генотаксономическая характеристика.

Выделено и охарактеризовано 9 структурных белков вируса ИРТ: VP 105, VP 90 (гемагглютинин), VP 74, VP 64, VP 54, VP 50, VP 47, VP 40, VP 31. Гликопротеины g^I, g^III, g^IV участвуют в формировании гуморального и клеточного иммунитета. Наиболее эффективным в этом отношении являются ^IV. По данным реакции нейтрализации, наибольшей иммуногенностью обладают VP 90 и VP 74. Белок, маркированный как VP 8 с мол. м. 96 кД, является одним из главных белков герпесвируса-1 КРС. Он участвует в модуляции экспрессии генов класса А. У телят он стимулирует пролиферацию Т-клеток и образование антител как после заражения, так и после иммунизации очищенным белком. За индукцию вируснейтрализующих антител герпесвируса-1 КРС ответственны 4-х оболочечные гликопротеины, главными из них являются g⁷⁰ и g⁹⁷. ГА-активность вируса связана с мажорным g⁹⁷, расположенным в шипиках вириона. В структуре g^IV вируса ИРТ идентифицированы 3 нейтрализующих домена. Домен 1 содержит 2 перекрывающих эпитопа, домен 2 – один эпитоп. Домен 1 имеет отношение к проникновению вируса в клетки-мишени.

Устойчивость к внешним факторам.

Штамм “ВНИИЗЖ” устойчив к воздействию низких температур, при минус 60-70^oС вирус выживает 7-9 месяцев, при 56^oС инактивируется через 20 минут, при 37^oС через 4-10 суток, при 22^oС через 50 суток. При 4^oС активность вируса снижается через 30-40 суток лишь на 1 1g.

Растворы формалина 1:500 инактивируют вирус через 24 часа. Ацетон, эфир, хлороформ и этиловый спирт инактивируют его немедленно. В кислой среде вирус быстро теряет свою активность, но длительно (до 9 мес) сохраняется при рН 6-9 и в условиях 4^oС.

Лиофилизация почти не влияет на его активность, однако многократное замораживание и оттаивание снижают вирулентность и иммуногенность вируса.

Дополнительные признаки и свойства.

Иммуногенная активность – 100%.

Патогенность – выражена.

Вирулентность – выражена.

Контагиозность – выражена.

Онкогенность – отсутствует.

Свободен от контаминации бактериями, микоплазмами и другими гемагглютинирующими вирусами.

На основании полученных данных можно утверждать, что штамм “ВНИИЗЖ” по антигенному и иммунологическому спектрам является оригинальным, в таксономическом отношении новым, ранее неизвестным изолятом вируса ИРТ КРС. Для снижения его эпизоотической опасности необходима своевременная профилактика вновь возникающих очагов болезни, а для этого необходима высокоактивная и безвредная вакцина.

По мнению заявителя, предлагаемый штамм обладает установленными Патентным законом России признаками патентоспособности “новизна” и “изобретательский уровень”.

Сущность предлагаемого изобретения пояснена примерами его использования.

Пример 1.

Исходный вирус для получения штамма “ВНИИЗЖ” выделен из патологического материала (трахея, легкое, лимфатические узлы, селезенка) от павших телят с явлениями ИРТ во время вспышки заболевания в СПК “Миневское” Нижегородской области в 1998 году. Вакцинный штамм получен во Всероссийском научно-исследовательском институте защиты животных путем культивирования в перевиваемых культурах клеток ВНК-21, МДВК и 3КГ.

Из патологического материала готовили 20% суспензию в буферном растворе (50 мМ HCl, рН 8,0; 100 мМ NaCl; 1 мМ ЭДТА), которую осветляли низкоскоростным центрифугированием, надосадок концентрировали 7% ПЭГ, экстрагировали равным объемом буферного раствора и очищали ультрацентрифугированием в перформированном градиенте плотности CsCl-сахароза. Полученный вирус использовали для последующего пассирования.

Результаты исследований по адаптации вируса ИРТ штамма “ВНИИЗЖ” к культурам клеток ВНК-21, МДВК и 3КГ представлены в табл. 1, 2 и 3.

Полученный вирус был подвергнут всестороннему контролю в соответствии с руководством МЭБ по стандартным диагностическим методам и вакцинам (1996) и на уровне третьего пассажа заложен на хранение в качестве матровой расплодки. Вирус матровой расплодки с титром инфекционной активности 6,5-7,0 lg ТЦД₅₀/см³ представлен в виде нативной суспензии культуральной жидкости и пораженного монослоя, хранится при температуре – 40^oС.

Полученному штамму вируса ИРТ КРС присвоено авторское наименование “ВНИИЗЖ”.

Пример 2.

С целью определения биологической, антигенной и иммунологической активности вируса ИРТ КРС штамма “ВНИИЗЖ” осуществляли гипериммунизацию кроликов живой массой 2,5-3,0 кг.

Для получения антигена исходную вируссодержащую суспензию в виде 3-5 пассажа в культуре клеток МДВК троекратно замораживали-оттаивали. После этого вирусную жидкость осветляли низкоскоростным центрифугированием (2500-3000 об/мин) в течение 30 мин.

Инактивацию вирусной суспензии проводили рабочим раствором аминоэтилэтиленимина (АЭЭИ). Во избежание изменения рН вирусной суспензии рабочий раствор АЭЭИ предварительно доводили 5М раствором уксусной кислоты до рН 7,8-8,2. Конечная концентрация инактиванта составила 0,1-0,15%. Смесь тщательно встряхивали и выдерживали при 37^oС в течение 24 часов.

Концентрирование антигена проводили добавлением в суспензию инактивированного вируса 50% раствора ПЭГ М.м. 6000 до конечной концентрации 8-10% по сухому веществу. Смесь выдерживали в течение 16-18 часов при 4^oС до формирования осадка. Осадок отделяли центрифугированием при 5000 об/мин в течение 30-40 мин и ресуспендировали в минимальном объеме раствора Хенкса (рН 7,2-7,4).

Для гипериммунизации кроликов использовали эмульсию инактивированного и концентрированного вируса ИРТ штамма “ВНИИЗЖ”. Для изготовления эмульсии использовали минеральные или синтетические масла с соответствующими эмульгаторами. Стерильный адъювант в равных объемах смешивали с антигеном и гомогенизировали до получения стойкой водно-масляной эмульсии.

Животным вводили эмульсию инактивированного вируса ИРТ КРС штамм “ВНИИЗЖ” в объемной дозе 2 см³ с титром возбудителя до инактивации не ниже 6,5-7,0 lg ТЦД₅₀/см³ в мякиши подушечек задних лапок. На 7 день инъекцию проводили в подколенные лимфоузлы, на 21 день внутримышечно по 2 см³ эмульсии.

Через 10-15 дней после окончания гипериммунизации кроликов обескровливали, получали сыворотки крови индивидуально от каждого животного. Каждую сыворотку проверяли на активность и специфичность в РНГА. Результаты исследований представлены в табл. 4.

Приведенные в табл. 4 данные характеризуют высокую биологическую антигенную и иммунологическую активность штамма “ВНИИЗЖ” вируса ИРТ КРС при введении в организм лабораторных животных.

Пример 3.

Для получения сорбированной инактивированной вакцины против ИРТ КРС матровый вирус штамма “ВНИИЗЖ” репродуцируют заражением монослоя культуры клеток МДВК и ВНК-21, выращенных в 1,5 дм³ матрасах или вращающихся сосудах объемом 3 дм³. Охлажденную при 4^oС вируссодержащую суспензию, соблюдая стерильные условия, освобождают от клеточного детрита известным способом, используя низкоскоростное центрифугирование и сливают в емкость. Освобожденная от детрита суспензия должна иметь вид прозрачной жидкости розового или вишневого цвета. Затем из емкости отбирают пробу для производственного контроля вирусного сырья. Производственная серия вируса ИРТ должна иметь инфекционную активность не меньше 6,0 lg ТЦД₅₀/см³, активность в РДП не меньше 4,0 log₂.

Инактивацию вирусного сырья осуществляют с помощью 6% раствора АЭЭИ, вносимого в суспензию вируса ИРТ до конечной концентрации 0,1%. Для этого в суспензию, подогретую до 26-28^oС, вносят при постоянном перемешивании раствор АЭЭИ и устанавливают рН суспензии в пределах 7,6-7,8 5М раствором уксусной кислоты или аммиака. Инактивацию проводят при температуре 36-37^oС в течение 24 ч периодическим помешиванием (каждые 5-6 ч по 3-5 мин).

По окончании процесса инактивации материал охлаждают до 2-8^oС и исследуют на полноту инактивации. В качестве адъюванта – сорбента в вакцине используют стерильный 3-4% коллоидный раствор гидроокиси алюминия (ГОА). Концентрацию и объем ГОА в конечном препарате и прививной дозе определяют по известной формуле в зависимости от титра вируса в исходной суспензии. Смесь суспензии с ГОА перемешивают в течение 1 ч и оставляют для седиментации. Затем в полуфабрикат вакцины дополнительно добавляют 10% водный раствор адъюванта сапонина из расчета 2,0 мг на дозу вакцины, доводя концентрацию сапонина в объеме препарата до 0,04%. Смесь перед расфасовкой выдерживают при температуре 2-6^oС в течение 120 ч при периодическом перемешивании.

Оптимальный компонентный состав (мас.%) полученной вакцины против ИРТ КРС приведен в табл. 5.

Содержание антигена в вакцине в указанных выше пределах является его эффективным количеством в препарате, обеспечивающим достижение технического результата.

Полученную вакцину контролируют на авирулентность и стерильность, а затем фасуют в стерильные флаконы.

Стерильность вакцины определяют в соответствии с ГОСТ 28085-89. Авирулентность препарата определяют методом двукратных последовательных пассажей инактивированного антигена в перевиваемой культуре клеток МДВК по отсутствию ЦПД.

Полученная вакцина представляет собой жидкость розового цвета с рыхлым осадком сорбента, который при встряхивании легко разбивается в гомогенную взвесь.

Определение безвредности вакцины проводят на морских свинках или кроликах. Для этого препарат вводят подкожно в области спины в дозе 2,0 см³ десяти морским свинкам или трем кроликам в дозе 5 см³.

Вакцина считается безвредной, если лабораторное животное в течение 10 суток наблюдения остаются клинически здоровыми, без каких-либо патологических изменений. На месте введения допускается местная тканевая реакция.

Антигенную активность каждой серии вакцины проверяют на кроликах. Вакцину вводят двукратно с интервалом 20-25 суток трем кроликам подкожно в области спины в объеме по 2 см³. Через 14 суток после повторного введения у кроликов берут пробы крови, выдерживают при 37^oС, отделяют сыворотку и исследуют на наличие антител к вирусу ИРТ в РНГА. Серию вакцины считают прошедшей контроль на антигенную активность, если титр вирусспецифических антител к вирусу ИРТ в РНГА не ниже 4,0 log₂.

Результаты исследований представлены в табл. 6 и 7. Из данных, приведенных в табл. 6 и 7, видно, что инактивированная вакцина против ИРТ КРС из штамма “ВНИИЗЖ” обладает высокоантигенной активностью.

При изучении иммунологической активности инактивированной сорбированной вакцины против ИРТ КРС из штамма “ВНИИЗЖ” установлено, что у телят 20-30-дневного возраста, привитых двукратно внутримышечно, уже на 14 день после введения препарата индуцируется иммунный ответ, обеспечивающий 90-100% образование гуморальных антител и защиту животных от заболевания. Экспериментально показано, что одна прививная доза в объеме 5 см³ содержит не менее 20 ИМД₅₀. Результаты исследований представлены в табл. 8.

Таким образом, приведенная выше информация свидетельствует о выполнении при использовании предлагаемого изобретения следующей совокупности условий:
– штамм “ВНИИЗЖ” вируса ИРТ КРС, воплощающий предлагаемое изобретение, предназначен для использования в сельском хозяйстве, а именно в ветеринарной вирусологии и биотехнологии;
– для предлагаемого изобретения в том виде, как оно охарактеризовано в неизвестном пункте формулы изобретения, подтверждена возможность его осуществления с помощью описанных в заявке или известных до даты приоритета средств и методов;
– штамм “ВНИИЗЖ”, полученный в соответствии с предлагаемым изобретением, обладает высокой антигенной и иммуногенной активностью и пригоден для изготовления вакцинных препаратов против ИРТ КРС.

Следовательно, предлагаемое изобретение соответствует условию патентоспособности “промышленная применимость”.

Источники информации
1. Инфекционные болезни животных: Справочник. Под ред. Д.Ф. Осидзе. -М.: Агропромиздат, 1987, 19-99.

2. Юров К.П. и Шуляк А.Ф. Герпесвирусы-возбудители массовых заболеваний крупного рогатого скота. Ветеринария, 1998, 11, 10-12.

3. Сюрин В.Н., Самуйленко А.Я., Соловьев Б.В. и Фомина Н.В. Вирусные болезни животных. -М., ВНИТИБП, 630-646.

4. Авт. свид. СССР 692128, А 61 К 30/118, 1977 г.

5. Авт. свид. СССР 980307, А 61 К 39/12, 1981 г.

6. Авт. свид. СССР 1789219; А 61 К 39/118, 39/12; 21.03.93 г.

7. Пат. РФ 2059415, А 61 К 39/265, 10.05.96 г.

8. Пат. РФ 2090210, А 61 К 39/265, С 12 N 5/06; 7/00; 20.09.97 г.

9. Пат. ЧССР 208289, А 61 К 39/265, 31.12.80 г.

10. Пат. Великобритании 2052983, А 61 К 39/265, 04.02.81 г.

11. Пат. США 4291019, А 61 К 39/265, 22.09.81 г.

Формула изобретения

Штамм “ВНИИЗЖ” вируса инфекционного ринотрахеита крупного рогатого скота сем. Herpesviridae, род Varicellavirus, коллекция ВГНКИ “ВНИИЗЖ-ДЕП”, для изготовления вакцинных и диагностических препаратов.

РИСУНКИ

MM4A – Досрочное прекращение действия патента СССР или патента Российской Федерации на изобретение из-за неуплаты в установленный срок пошлины за поддержание патента в силе

Дата прекращения действия патента: 29.06.2006

Извещение опубликовано: 10.06.2007 БИ: 16/2007