Патент на изобретение №2221039

(54) СПОСОБ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ МОНОНУКЛЕАРОВ КРОВИ in vitro

(57) Реферат:

Изобретение относится к области экспериментальной медицины. Способ культивирования предусматривает инкубирование в камере клеточного материала в жидкой питательной среде при 37^oС. Перед инкубированием клеточный материал размещают на полупроницаемом фильтре, установленном в камере, предварительно заполненной жидкой питательной средой. В процессе инкубирования при помощи насоса осуществляют направленное движение жидкой питательной среды со скоростью 8-12 см³/мин из сборника питательной среды и обратно. Инкубирование проводят в течение трех суток. Изобретение обеспечивает уменьшение длительности культивирования и увеличение численности получаемых клеток. 1 ил.

Изобретение относится к области экспериментальной медицины, конкретно к способам культивирования мононуклеаров крови in vitro.

Известен способ культивирования мононуклеаров крови in vitro, предусматривающий инкубирование в камере, например чашке Петри, клеточного материала в жидкой питательной среде при температуре 37^oС, содержании СО₂ 5,0-7,0%, влажности 100% и длительности культивирования 8-10 суток (Адамc Р. Методы культуры клеток для биохимиков. Москва, “Мир”, 198, с.68). Культивируемые клетки помещают в жидкую питательную среду, содержащую все необходимые компоненты для их жизнеобеспечения.

Однако условия культивирования недостаточно близки к естественным условиям их жизнеобеспечения.

Способ является длительным и не позволяет обеспечить большую численность культивируемых клеток.

Технический результат изобретения заключается в уменьшении длительности культивирования, создании условий культивирования мононуклеаров, наиболее близких к естественным условиям организма (полость глазного яблока,) и увеличении численности получаемых клеток.

Этот технический результат достигается тем, что в предложенном способе, предусматривающем инкубирование в камере клеточного материала в жидкой питательной среде при 37^oС, перед инкубированием клеточный материал размещают на полупроницаемом фильтре, установленном в камере, предварительно заполненной жидкой питательной средой. В процессе инкубирования при помощи насоса осуществляют направленное движение жидкой питательной среды со скоростью 8-12 см³/мин из сборника питательной среды и обратно, и инкубирование проводят в течение трех суток.

Изобретение поясняется технологической схемой, изображенной на чертеже.

Способ осуществляют следующим образом.

Исходный клеточный материал, представляющий мононуклеары крови человека, получают, например, методом фракционирования в градиенте плотности на разделяющем растворе фиколла и гипака (см. Новиков Д.К., Новикова В.И. Клеточные методы иммунодиагностики, Минск, Беларусь, 1979, с.222).

Клеточный материал размещают на полупроницаемом фильтре 1, установленном в камере 2, предварительно заполненной жидкой питательной средой, содержащей 80% среды McCoy 5A, 20% эмбриональной телячьей сыворотки и гентамицин (из расчета 0,02 мл на 10 мл среды). Клеточный материал вводят в камеру 2 при помощи шприца через отверстие 3 с клапаном в ее боковой стенке. Камера 2 сообщена со сборником 4 питательной среды при помощи роликового насоса 5, снабженного клапаном 6. Используют, например, аппарат 7 “Аспиратор-01.

После включения роликового насоса 5 в сеть в замкнутой системе в результате его работы создают равномерное однонаправленное движение питательной среды со скоростью 8-12 см³/мин. Клеточную культуру инкубируют при 37^oС и 100% влажности при постоянном движении жидкой питательной среды в течение 3 суток. По окончании процесса культивирования полупроницаемый фильтр извлекают из камеры 2 и клеточный материал фиксируют и окрашивают по методу Романовского-Гимзы.

В ходе микроскопии среди полученных в результате культивирования мононуклеаров с типичным строением ядра и цитоплазмы обнаруживают эпителиоидные клетки. Большинство из них поляризовано и имеет характерную форму вытянутой трапеции или параллелепипеда.

При культивировании в обычных, стандартных условиях в чашке Петри небольшое количество эпителиоидных клеток обнаруживается на 8-10 сутки культивирования, в то время как при культивировании предлагаемым способом указанные клетки обнаруживаются в достаточном количестве уже на 3 сутки.

Необходимость создания условий для однонаправленного движения питательной среды при культивировании клеток in vitro обосновывается тем, что в настоящее время все более очевидным становится зависимость между морфофункциональными особенностями клеток и состоянием их клеточных поверхностей. Большой интерес в этом отношении представляют мононуклеары крови. В отличие от других высокоспециализированных клеток системы крови мононуклеары обладают функциональной полипотентностью, т.е. они могут реализовывать разные потенции генома в зависимости от тех или иных регуляторных воздействий. Одним из факторов, обеспечивающих и регулирующих межклеточные и клеточно-структурные взаимодействия, является однонаправленное движение жидкости в тканях глаз, создаваемое градиентом давления.

Внутриглазная жидкость, продуцируемая цилиарным телом, проходит через хрусталик, стекловидное тело, внутренние слои сетчатки и всасывается ретинальными сосудами, что подтверждается результатами флуоресцентной ангиографии. Установлено, что однонаправленное движение внутриглазной жидкости может оказывать влияние на адгезированные на фибриллах стекловидного тела клетки, изменяя ее морфофункциональное состояние.

Результаты культивирования мононуклеаров крови in vitro предлагаемым способом свидетельствуют о влиянии однонаправленного движения жидкости на морфофункциональное состояние клеток. Выбранная на основании экспериментальных исследований скорость движения питательной среды является оптимальной и обеспечивает получение достаточного количества эпителиоидных клеток в более короткие сроки (на 3 сутки). Использование скорости меньшей величины недостаточно для достижения поставленной цели, использование же скорости большей величины ведет к механическому повреждению клеток.

Изобретение открывает новые возможности для проведения экспериментальных работ по изучению механизмов межклеточных и клеточно-структурных взаимодействий с целью выяснения их роли в патогенезе пролиферативной витреоретинопатии.

Формула изобретения

Способ культивирования мононуклеаров крови in vitro, предусматривающий инкубирование в камере клеточного материала в жидкой питательной среде при 37С, отличающийся тем, что перед инкубированием клеточный материал размещают на полупроницаемом фильтре, установленном в камере, предварительно заполненной жидкой питательной средой, при этом в процессе инкубирования при помощи насоса осуществляют направленное движение жидкой питательной среды со скоростью 8-12 см³/мин из сборника питательной среды и обратно и инкубирование проводят в течение трех суток.

РИСУНКИ

MM4A Досрочное прекращение действия патента Российской Федерации на изобретение из-за неуплаты в установленный срок пошлины за поддержание патента в силе

Дата прекращения действия патента: 08.05.2004

Извещение опубликовано: 27.04.2005 БИ: 12/2005

NF4A Восстановление действия патента Российской Федерации на изобретение

Извещение опубликовано: 10.09.2005 БИ: 25/2005

MM4A – Досрочное прекращение действия патента СССР или патента Российской Федерации на изобретение из-за неуплаты в установленный срок пошлины за поддержание патента в силе

Дата прекращения действия патента: 08.05.2006

Извещение опубликовано: 10.04.2008 БИ: 10/2008