Патент на изобретение №2220563

(54) СПОСОБ КРИОСОХРАНЕНИЯ МЕРИСТЕМ, ИЗОЛИРОВАННЫХ ИЗ РАСТЕНИЙ ЗЕМЛЯНИКИ САДОВОЙ (Fragaria L.) in vitro

(57) Реферат:

Изобретение относится к биотехнологии, в частности к способу криосохранения меристематических апексов, изолированных из закаленных in vitro растений земляники садовой (Fragaria L.). Данный способ заключается в подготовке растений-доноров меристем к замораживанию, выделении апексов и их обработке криопротекторами, охлаждении апексов в криоампулах до сверхнизких температур, хранении ампул с меристемами в жидком азоте и посткриогенной регенерации растений из меристем. Причем растения-доноры меристем закаливают на твердой агаровой питательной среде, дополненной 6% сахарозы или глюкозы в течение 1-2 месяцев, а криогенное охлаждение апексов проводят со скоростью 0,30-0,33^oС/мин в криоампулах, заполненных раствором криопротекторов со льдом. Предлагаемый способ позволяет эффективно восстанавливать растения различных сортов земляники садовой из криосохраненных меристем после криогенного хранения. 1 ил., 2 табл.

Изобретение относится к биотехнологии, в частности к сохранению генетических ресурсов вегетативно размножаемых растений, и может использоваться в садоводстве для длительного криогенного хранения оздоровленных клонов ценных сортов земляники садовой (Fragaria L.).

В настоящее время криобанк – наиболее компактная и экономичная форма сохранения генетических ресурсов сельскохозяйственных и дикорастущих растений, необходимых человечеству как в настоящее время, так и в будущем. Долговременное криогенное хранение изолированных меристем является одним из перспективных методов сохранения генетических ресурсов вегетативно размножаемых растений, в частности оздоровленных клонов ценных сортов ягодных и плодовых культур, поэтому надежный способ криосохранения меристем земляники может стать основой для создания криобанка ценных отечественных и районированных в России иностранных сортов земляники садовой.

В этом способе авторы культивировали in vitro растения земляники и выделяли из них меристематические верхушки (апексы).

^oС по каплям добавляли криопротекторы.

Затем изолированные апексы в криоампулах охлаждали медленно со скоростью 0,5-1,0^oС/мин до – 40^oС и погружали в жидкий азот (-196^oС) на срок не менее 1 ч.

Стадию посткриогенного восстановления растений из меристем проводили на питательной среде МС, дополненной бензиламинопурином, индолил-масляной кислотой и гибберелловой кислотой при 26^oС, 16-часовом дне и освещенности 4 клк.

В результате из криосохраненных меристем земляники сорта Redcoat, авторы (K.K.Kartha, N.L.Leung, K.Pahl), получали в среднем 55% регенерантов.

Однако воспроизведение указанного способа, по описанию, приведенному в статье, на других сортах земляники (Гренада – 0-10%, Эльвира – 0%, Зенга-Тигайга – 0% посткриогенной регенерации), в наших условиях не позволило получить ожидаемого эффекта.

С нашей точки зрения недостатком этого способа является отсутствие в процессе подготовки растительного материала к криосохранению стадии закаливания растений-доноров меристем и отсутствие льда в ампулах при их криогенном охлаждении.

В этом способе маточные растения земляники, размноженные in vitro, закаливали в течение 1 недели на модифицированной питательной среде.

Изолированные из них меристематические верхушки (0,8 мм длиной) 48 ч культивировали на агаризованной (0,8%) питательной среде в условиях закаливания с 5% диметилсульфоксида (ДМСО), а затем переносили в расположенные на льду пластиковые криоампулы, куда добавляли по каплям в течение 30 мин смесь криопротекторов (PGD) из 10% полиэтиленгликоля (М.В.=8000), 10% глюкозы и 10% диметилсульфоксида.

После этого меристематические верхушки, обработанные PGD, избавляли от его избытка и в криоампулах с раствором криопротекторов, с помощью программируемого замораживателя охлаждали со скоростью 0,8^oС/мин до – 40^oС с последующим погружением в жидкий азот на 1 ч.

Ампулы с меристемами, извлеченные из жидкого азота, оттаивали в водяной бане при +40^oС и переносили в воду (+23^oС). Затем криопротекторы в ампулах заменяли на жидкую среду, меристематические верхушки вынимали из ампул и помещали сначала на стерильную фильтровальную бумагу, а потом на ростовую среду.

В результате этот способ позволил авторам (Б.Рид и К.Хаммеру) получить после замораживания из меристем 56 генотипов – регенеранты 48 генотипов, причем не было получено регенерантов сорта Tribute, а процент посткриогенного восстановления растений колебался от 0 до 100% (57,615,6).

Недостатками этого способа мы считаем непродолжительный период закаливания растений-доноров меристем и отсутствие льда в криоампулах перед началом их программного охлаждения, что приводит, по нашему мнению, к нестабильности результатов и отсутствию посткриогенной регенерации у восьми из 56 генотипов, включая и сорт Трибьют.

Задачей, на решение которой направлено настоящее изобретение, является стабильное получение после жидкого азота растений – регенерантов земляники садовой различных сортов из каждой криоампулы, содержащей не менее 20 апикальных верхушек.

Поставленная задача решается тем, что в способе криосохранения меристематических апексов, изолированных из закаленных in vitro растений земляники садовой (Fragaria L.), заключающемся в подготовке растений – доноров меристем к замораживанию, выделении апексов и их обработке криопротекторами, охлаждении апексов в криоампулах до сверхнизких температур, хранении ампул с меристемами в жидком азоте, и посткриогенной регенерации растений из меристем, проводят последовательно:
закаливание растений-доноров 1-2 месяца на твердой агаризованной питательной среде, дополненной 6% сахарозой или глюкозой,
обработку изолированных меристем перед замораживанием – 18-19 ч на жидкой питательной среде с криопротекторами 6% сахарозы или глюкозы и 5-7% ДМСО,
охлаждение апексов в криоампулах, заполненных раствором 6% сахарозы или глюкозы и 7-9% ДМСО, содержащим лед, в программном замораживателе по оригинальной программе со скоростью 0,3-0,33^oС/мин до -38-40^oС, затем со скоростью 9-11^oС/мин до -75^oС с погружением в жидкий азот (-196^oС) на срок не менее часа;
посткриогенное восстановление растений из оттаявших меристем, освобожденных от избытка криопротекторов, первый этап которого проходит на модифицированной питательной среде с 0,5-1 мг/л бензиламинопурина и 3%-ными глюкозой или сахарозой при 19-20^oС, 16-часовом дне и освещенности 0,5-1 клк.

На чертеже представлена принципиальная схема криосохранения меристем, изолированных из растений культивированных и закаленных in vitro, включающая в себя не только этапы подготовки растительного материала к замораживанию, его хранения в жидком азоте и восстановления из криогенного сна, но и все традиционные процедуры культивирования растений при клональном размножении in vitro. Эта схема представляет собой полный цикл преобразований растительного материала от обычного растения до растения восстановленного после хранения в жидком азоте, способного нормально размножаться и плодоносить в грунте.

Суть настоящего изобретения в том, что предлагаемый способ криосохранения меристем земляники садовой представляет собой совокупность модифицированных этапов известных методов замораживания живых объектов и эффективно обеспечивает получение после процедуры криосохранения растений-регенерантов всех испытанных нами сортов земляники из каждой криосохраненной ампулы, содержащей не менее 20 меристем.

Заявленный способ отличается от прототипа тем, что растения-доноры меристем закаливают в течение 1-2 месяцев в присутствии 6% сахарозы или глюкозы, а замораживание проводят в ампулах, содержащих не только криопротекторы, но и лед.

Изобретение иллюстрируется следующими примерами:
Пример 1
Растения земляники садовой сортов Трибьют и Джеско размножают in vitro на агаризованной питательной среде МС (таблица 1), дополненной 3% сахарозой и 1 мг/л бензиламинопурина. Маточные растения земляники, полученные в результате размножения, закаливают на модифицированной питательной среде (ПС-1) с 6% сахарозой и в течение 2 месяцев в темноте при температуре 44^oС (таблица 1). Затем изолированные из них меристематические верхушки 18 ч культивируют на жидкой питательной среде (ПС-1), дополненной 6% сахарозой и 5% ДМСО (таблица 1) при 4^oС в темноте и переносят в криоампулы с 6% сахарозы и 7% ДМСО. Криоампулы с меристематическими верхушками, содержащие лед, охлаждают в программном замораживателе ЗРК-1 со скоростью 0,3^oС/мин до -40^oС, а затем со скоростью 9^oС/мин до -75^oС, и помещают на хранение в жидкий азот (-196^oС). После криогенного хранения не менее часа ампулы с меристемами оттаивают в водяной бане при 38^oС. Размороженные меристемы извлекают из ампул и освобождают от криопротекторов последовательным перемещением сначала на сухую стерильную фильтровальную бумагу, затем дважды на свежую полужидкую питательную среду с агарозой (ПС-3), дополненную 3% сахарозы и 0,5 мг/л бензиламинопурина (таблица 1). После процедуры освобождения от криопротекторов меристемы помещают на среду ПС-3 для рекультивирования при 18^oС 16-часовом дне и освещенности 0,5-1 клк. После месяца культивирования из 37-100% меристем были восстановлены растения с листьями и корнями, минуя стадию каллусообразования.

Пример 2
Растения земляники садовой сорта Кокинская поздняя, принадлежащие к одному мериклону, размножают in vitro на агаризованной питательной среде МС-1 (таблица 1), дополненной 2% сахарозой, 1% глюкозой и 2 мг/л бензиламинопурина. Маточные растения земляники, полученные в результате размножения, переносят на модифицированную питательную среду (ПС-1) с 6% глюкозой и закаливают их в течение 1 месяца в темноте при температуре 44^oС (таблица1). Затем изолированные из них меристематические верхушки 19 часов культивируют на жидкой питательной среде (ПС-2), дополненной 6% глюкозой и 7% ДМСО (таблица 1) при 44^oС в темноте и переносят в криоампулы с 6% глюкозы и 9% ДМСО. Криоампулы с меристематическими верхушками, содержащие лед, охлаждают в программном замораживателе ЗРК-1 со скоростью 0,33^oС/мин до -40^oС, а затем со скоростью 11^oС/мин до -75^oС и помещают на хранение в жидкий азот (-196^oС). После криогенного хранения не менее часа ампулы с меристемами оттаивают в водяной бане при +40^oС. Размороженные меристемы извлекают из ампул и освобождают от криопротекторов последовательным перемещением сначала на сухую стерильную фильтровальную бумагу, затем дважды на свежую полужидкую питательную среду с агарозой (ПС-4), дополненную 3% глюкозы и 1,0 мг/л бензиламинопурина (таблица 1). После процедуры освобождения от криопротекторов меристемы помещают на среду ПС-4 для рекультивирования при 20^oС 16-часовом дне и освещенности 0,5-1,0 клк. После месяца культивирования из 70-100% меристем были восстановлены растения с листьями и корнями, минуя стадию каллусообразования.

Пример 3
Изолированные апексы земляники садовой различных сортов (таблица 2) замораживают до -196^oС в соответствии со схемами, представленными в примерах 1 и 2.

Из результатов таблицы 2 следует, что предлагаемый способ криосохранения позволяет после криогенного хранения (не менее 20 меристем в каждой ампуле) восстанавливать растения 16 различных сортов из 62,59,0% криосохраненных меристем, причем у сорта Трибьют посткриогенная регенерация достигала – 66,96,8%, а у сорта Кокинская поздняя – 85,55,6%.

Формула изобретения

Способ криосохранения меристем, изолированных из растений земляники садовой (Fragaria L.) in vitro, заключающийся в подготовке растений-доноров меристем к замораживанию, выделении апексов и их обработке криопротекторами, охлаждении апексов в криоампулах до сверхнизких температур, криосохранении ампул с меристемами, посткриогенной регенерации растений из криосохраненных меристем, отличающийся тем, что растения-доноры меристем закаливают на твердой агаровой питательной среде, дополненной 6% сахарозы или глюкозы в течение 1-2 месяцев, а криогенное охлаждение апексов, со скоростью 0,30-0,33С/мин, проводят в криоампулах, заполненных раствором криопротекторов со льдом.

РИСУНКИ

MM4A Досрочное прекращение действия патента Российской Федерации на изобретение из-за неуплаты в установленный срок пошлины за поддержание патента в силе

Дата прекращения действия патента: 25.05.2004

Извещение опубликовано: 20.02.2006 БИ: 05/2006