Патент на изобретение №2220458

(54) СПОСОБ МОДЕЛИРОВАНИЯ ОПУХОЛЕВОГО ПРОЦЕССА ЯИЧКА, ПРИМЕНЯЕМЫЙ ДЛЯ ИССЛЕДОВАНИЯ ЕГО РЕГИОНАРНОГО ЛИМФАТИЧЕСКОГО РУСЛА

(57) Реферат:

Изобретение относится к области медицины, а именно к урологии, экспериментальной онкологии и лимфологии, и может быть применено для моделирования опухолевого процесса в яичке и для изучения реакции его регионального лимфатического русла. В паренхиму яичка вводится асцитная карцинома Эрлиха в концентрации 2,5-5,010⁵ опухолевых клеток на 1 мл. Способ позволяет надежно и быстро развивать опухоль без нарушения топографической анатомии яичка, его кровоснабжения и лимфоотока. 12 ил.

Изобретение относится к области медицины, а именно к урологии, экспериментальной онкологии и лимфологии, и может быть применено для моделирования опухолевого процесса в яичке и для изучения реакции его регионарного лимфатического русла.

Интерес к проблеме злокачественных опухолей яичка обусловлен тем, что составляя всего около 2% в структуре заболеваемости опухолями мочеполовой системы (Н.А. Лопаткин, 1992), они являются одной из основных причин смерти от рака среди мужчин молодого возраста (до 35 лет), то есть наиболее репродуктивно способной и социально значимой части населения. Несмотря на значительное улучшение результатов лечения опухоли яичка, с внедрением в схемы полихимиотерапии цитостатиков на основе платины, смертность от поздних стадий заболевания, в зависимости от гистологического строения опухоли, составляет по данным ВОЗ (1999 год) от 68 до 100%. Основной причиной, приводящей к гибели пациентов с опухолью яичка, является ее метастазирование как по кровеносным сосудам, так и по лимфатическим путям (Маринбах Е.Б., 1977). Поэтому является актуальным разработка новых цитостатиков и исследование их действия на опухолевый рост и лимфатическую систему. Для фундаментальных исследований создаются модели опухоли яичка на лабораторных животных. В литературе описано достаточно много способов моделирования опухоли яичка. Их можно условно разделить на 2 группы:
И.О. Михайловский в 1928 г. впервые получил 10 тератоидных опухолей яичка с помощью инъекций в яичко петухов 5% раствора хлористого цинка. Было установлено, что индукция опухоли удавалась только в весенние месяцы, т.е. в период наиболее активного сперматогенеза. Л.И. Фалин и соавторы (1940, 1946) ввели растворы хлористого цинка в яички 116 петухам и только лишь у 15 петухов были получены опухоли. В 1966 г. Б.В. Ключарев получил опухоли яичка с помощью канцерогенного углеводорода – он вводил 135 крысам и 31 мыши 9,10-диметил,1,2-безантрацен. Опухоль получена у 11 животных. Модели этой группы, основанные на введении в яичко химических канцерогенных веществ, отличаются невысоким процентом развития экспериментальных опухолей, кроме того, канцероген оказывает определенное влияние на лимфатическую систему, что нарушает чистоту эксперимента.

В 1959 году В. М. Бреслеру впервые удалось получить экспериментальные тератомы у мышей и крыс при введении в яичко прижигающей эмульсии и нарушении гормонального обмена путем введения малых доз тестостерона. Индукция опухоли удается только при сочетании двух указанных факторов.

Через несколько лет М. Ривьер и соавторы (1964) индуцировали сперматогенные семиномы у хомячков введением эстрогенов. Модели этой группы, основанные на создании искусственного гормонального фона, отличаются достаточно медленным развитием опухоли (до нескольких лет), создание их трудоемко, дорого, кроме того, процент развития опухоли не всегда высок.

Целью нашего исследования было создание такой модели опухоли яичка, которая бы отличалась надежностью и быстротой развития опухоли, по возможности, простотой создания, при этом не должна нарушаться топографическая анатомия яичка, его кровоснабжение и лимфооток. Кроме того, отсутствовали бы факторы, которые могли бы сами по себе вызывать реакцию лимфатической системы, которая бы затушевывала ответ лимфатической системы на опухоль и ее коррекцию.

До настоящего времени решающее значение при отборе противоопухолевых препаратов во всех странах мира имеют испытания in vivo на перевиваемых опухолях мышей и крыс (Ларионов Л.Ф., 1962; Бокаева С.С., 1965; Булкина З.П., 1972). Для терапевтических опытов рекомендуется использовать перевиваемые опухоли, которые до настоящего времени остаются основной моделью при первичном отборе противоопухолевых препаратов.

Перевиваемые опухоли животных являются более отдаленной моделью опухолей человека, чем спонтанные и индуцированные опухоли (Коноплев В.Н., 1960; Чернуха А.М., 1980). Последние стоят ближе к опухолям человека в том отношении, что образуются в организме заново, в то время как при перевивке происходит лишь перенос возникшей опухоли от одного животного к другому. Но в то же время перевиваемые опухоли имеют ряд значительных преимуществ, т.к. легко и быстро могут быть получены в большом количестве, это дает возможность постановки массовых экспериментов. Кроме того, перевиваемые опухоли характеризуются относительным постоянством строения и биологических свойств (Караиванова М.Х., 1971 Васильева Г.С. 1982).

В странах Западной Европы, объединенных в единую скрининговую группу EORTC (Европейская организация для исследований по лечению рака), первичный отбор in vivo ведется на лейкозе L 1210 и опухоли Эрлиха (Першин Г.Н.,1971; Софьина З.П., 1976).

Нами предлагается следующий способ моделирования опухоли яичка, который может быть с успехом использован, в том числе, и для изучения его регионарного лимфатического русла. Он заключается в следующем.

Непосредственно перед операцией у мыши – носителя опухоли Эрлиха шприцем из брюшной полости, в стерильных условиях, аспирируется 0,375 мл асцитической жидкости, содержащей большое количество клеток опухоли Эрлиха. Асцитическая жидкость помещается в стерильную чашку Петри, разбавляется 8 мл 0,9% раствора NaСl (физиологического раствора) и тщательно перемешивается. Путем подсчета клеток опухоли Эрлиха в камере Горяева по формуле высчитывается их концентрация в 1 мл. Концентрация 250000 клеток опухоли Эрлиха в 1 мл выведена опытным путем и должна считаться оптимальной, позволяя, с одной стороны, быть уверенным в том, что опухоль будет индуцирована, а с другой – обеспечивает необходимую продолжительность жизни экспериментальных животных. Мышь вводится в наркоз (мы применяли медицинский эфир). После удаления с операционного поля шерсти и обработки его (двукратно) дезинфицирующим раствором ножницами производится диагональный разрез кожи мошонки. Как показывает практика, у 90% процентов мышей яички находятся в брюшной полости. Стерильными ножницами выполняется разрез париетальной брюшины длинной 0,5 мл. Путем легкого надавливания на живот мыши яичко выводится в операционную рану. В паренхиму органа инсулиновым шприцем вводится 0,075 приготовленной заранее асцитической жидкости. После этого рана трижды обрабатывается антисептической раствором (фурациллин 1:5000, раствор борной кислоты). Яичко возвращается в брюшную полость. Кетгутом 3/0 на атравматической игле двумя одиночными узловыми швами ушивается дефект брюшины. Таким же способом ушивается кожа, операционная рана обрабатывается 2% раствором Н₂O₂. Повязка на рану не накладывается в связи со сложностью ее фиксации и низким риском нагноения раны – выявлено на основании собственного опыта.

Наблюдение за развитием опухолевого процесса проводилось в течение 15 суток.

Через 5 суток с момента прививки опухоли пораженное яичко на 3 мм по длиннику и на 2 мм по поперечнику больше интактного, резко уплотнено, видны участки кровоизлияний, форма еще остается правильной овальной, оболочки интимно подпаяны к паренхиме.

После умерщвления животных под эфирным наркозом по стандартной методике были изготовлены срединные продольные гистологические срезы с опухолевого узла толщиной 5-7 мкм, окрашенные гематоксилин-эозином и по Ван-Гизон. Микроскопическое исследование гистологических препаратов опухоли (увеличение 100, 400, 1000) показало, что на 5 сутки в нижней половине пораженного яичка (куда непосредственно и прививалась опухоль) наблюдается резко выраженный тканевой и клеточный атипизм (для сравнения на фиг.1 приведена микроскопическая картина здорового яичка). В месте инъекции опухолевых клеток (фиг.2) определяется скопление атипичных клеток, по периферии опухолевого узла очаги кровоизлияния, некроз железистой паренхимы яичка (фрагменты извитых семенных канальцев, инфильтрированных лейкоцитами, клеточный детрит), распространение бластных клеток. Опухоль представлена атипичными, полиморфными клетками (фиг. 3): крупные клетки с большими ядрами, крупные клетки с большими гиперхромными “уродливыми” ядрами, смещение ядер к периферии клеток, увеличение числа ядер в одной клетке. В верхней половине яичка атипичных клеток не обнаружено, железистая паренхима яичка сохранена. Отмечается выраженный лимфостаз, выявлены расширенные лимфатические капилляры и сосуды, содержащие большое количество жировых (фиг. 4, 5). По стандартной методике (метод “полей”) нами был произведен анализ ядерно-цитоплазматического и стромально-паренхиматозного соотношений в ткани опухоли. Для анализа клеток и тканей использовалась окулярная тест-система с 25 равноудаленными точками (Автандилов Г.Г., 1990 г.).

Результаты исследований показали, что в динамике роста опухоли происходит увеличение ядерно-цитоплазматического и стромально-паренхиматозного соотношений. В здоровом яичке ядерно-цитоплазматическое соотношение 1,4340,02, на 5 сутки ядерно-цитоплазматическое соотношение 2,1270,03, т. е. достоверно увеличивается на 48,32%; стромально-паренхиматозное соотношение в здоровом яичке составляет 0,0680,01, а на 5 сутки 0,1010,02, т.е. достоверно увеличивается на 48,52%.

Через 10 суток с момента прививки макроскопически размеры больного яичка на 7-8 мм по длиннику и на 3-4 мм в поперечнике больше, чем в интактном, яичко плотной “деревянистой” консистенции, серого цвета с очагами кровоизлияний, поверхность бугристая, оболочки интимно подпаяны к паренхиме.

При микроскопическом исследовании гистологических срезов опухоли на малом увеличении (об. 10*ок 10) через 10 суток с момента прививки повсеместно наблюдаются тяжи опухолевой ткани, между которыми определяются очаги некроза, кровоизлияния, остатки извитых семенных канальцев (фиг.6). На большом увеличении (об. 100*ок 10) опухолевые тяжи состоят из атипичных, полиморфных клеток: крупные клетки с большими ядрами, смещение ядер к периферии клеток, мелкие клетки с гиперхромными ядрами – выраженный полиморфизм опухолевых клеток. Бласты располагаются вокруг венул, наблюдается выраженный стаз крови в мелких сосудах. Отмечаются множественные митозы (фиг.7).

Ядерно-цитоплазматическое соотношение через 10 суток с момента прививки составляет 2,8650,03, что достоверно на 34,69% превышает такой же показатель на 5 сутки наблюдения. Стромально-паренхиматозное соотношение составило 0,1380,01, что достоверно на 36,63% превышает такой же показатель на 5 сутки наблюдения.

Через 15 суток с момента прививки макроскопически больное яичко в 2-2,5 раза больше интактного, плотной “деревянистой” консистенции с участками размягчения, серого цвета с очагами кровоизлияний, форма неправильная с бугристыми контурами, оболочки не дифференцируются.

При микроскопическом исследовании гистологических препаратов опухоли на малом увеличении (об.*10, ок*10) повсеместно определяется разрастание опухолевой паренхимы и стромы, компоненты нормальной тканевой структуры яичка практически отсутствуют (фиг.8). По периферии и внутри опухолевых тяжей наблюдается расширение прелимфатических, интерстициальных путей (фиг.8). При большом увеличении вокруг венул определяется скопление полиморфных, атипичных, опухолевых клеток (фиг.9): крупные клетки с большими ядрами, крупные клетки с большими гиперхромными “уродливыми” ядрами, смещение ядер к периферии клеток. На фиг.9 виден лизис стенки венулы, рядом атипичные клетки, содержащие гемосидерин. На 15 сутки ядерно-цитоплазматическое соотношение 3,3800,04, что достоверно на 17,97% превышает такой же показатель на 10 сутки 0,1760,02, что достоверно на 27,53% превышает такой же показатель на 10 сутки наблюдения. Данные, полученные при подсчете ядерно-цитоплазматического и стромально-паренхиматозного соотношений и сравнение этих показателей на разные сроки опухолевого роста свидетельствуют о тенденции нарастания как клеточного, так и тканевого атипизма.

Так же проводился микроскопический анализ гистологических срезов, окрашенных по стандартной методике гемотоксилином и эозином, регионарного лимфатического узла (правый парааортальный, околопочечный). На 15 сутки метастазы обнаружены в 1 из 6 (16,6%) исследованных лимфатических узлов. В другие сроки наблюдения метастазы не отмечены. При микроскопии выявлен одиночный метастаз в корковом веществе, представляющий собой скопление атипичных клеток (в основном полиморфные клетки опухоли, различные по размерам с крупными, смещенными к периферии ядрами и малым количеством цитоплазмы). В паренхиме лимфатического узла наблюдается расширение корковых промежуточных синусов, разрастание соединительной ткани, резкое расширение краевого синуса (фиг. 10, 11).

Морфогенез опухоли яичка у мышей при проведенном нами морфологическом, структурном анализе практически идентичен строению типичной семиномы у человека (фиг.12).

Список использованной литературы
1. Васильева Г.С. Биология трансплантируемых опухолей. – Алма-Ата, 1982. – С.47-58.

2. Булкина З.П., Киндзельский Л.П., Лосева И.М. Исследование препаратов на противолейкозную активность. Онкология (Республиканский межведомственный сборник). – Киев, 1972. – Вып.3. – С.164-167.

4. Маринбах Е. Б. Опухоли яичка и его придатка. – Москва.: Медицина, 1972. – С. 8-10, 25, 30.

5. Урология под редакцией Лопаткина Н.А. – Москва.: Медицина, 1995. – С. 428-429.

7. Коноплев А.Е. Перевиваемые опухоли. – В кн. Модели и методы экспериментальной онкологии. – М., Медгиз, 1960. – С.144-237.

8. Ларионов Л.Ф. Первичный отбор противоопухолевых препаратов. – В кн. Химиотерапия злокачественных опухолей. – Москва, 1962. – С.74-79.

9. Першин Г. Н. Методы экспериментальной химиотерапии. – М.: Медицина, 1971. 357-366.

11. Автандилов Г.Г. “Медицинская морфометрия”. – Москва, 1990. – С.382.

12. Beutow SA: Epidemiology of testicular cancer. Epidemiol Rev 17; 433, 1995.

Формула изобретения

Способ моделирования опухоли яичка, заключающийся во введении в паренхиму яичка индуктора опухолевого роста, отличающийся тем, что в паренхиму яичка вводится асцитная карцинома Эрлиха в концентрации 2,5-5,010⁵ опухолевых клеток на 1 мл.

РИСУНКИ

MM4A Досрочное прекращение действия патента Российской Федерации на изобретение из-за неуплаты в установленный срок пошлины за поддержание патента в силе

Дата прекращения действия патента: 19.06.2004

Извещение опубликовано: 27.05.2006 БИ: 15/2006