Патент на изобретение №2219242
|
||||||||||||||||||||||||||
(54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ БАККАТИНА И/ИЛИ ПРОИЗВОДНЫХ БАККАТИНА 10-ГИДРОКСИТАКСО-О-АЦЕТИЛТРАНСФЕРАЗА ДЛЯ ЕГО ОСУЩЕСТВЛЕНИЯ, СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ЭТОЙ АЦЕТИЛТРАНСФЕРАЗЫ И СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ТАКСОЛА И/ИЛИ ПРОИЗВОДНЫХ ТАКСОЛА
(57) Реферат: Изобретение относится к биотехнологии. Способ получения баккатина и/или производных баккатина предусматривает превращение 10-дезацетилбаккатина или производного 10-дезацетилбаккатина в присутствии 10-гидрокситаксо-О-ацетилтрансферазы и донора ацетильной группы. В качестве фермента использует ацетилтрансферазу с молекулярной массой 70-72 кДа, определяемой путем электрофореза в полиакриламидном теле в присутствии додецилсульфата натрия, которую получают из клеточных культур Taxus chinensis. Изобретение обеспечивает высокую региоспецифичность в отношении ацетилирования в положении 10, составляемую более 99%. 4 с. и 9 з.п.ф-лы, 5 табл. Текст описания в факсимильном виде (см. графическую часть)) Формула изобретения 1. Способ получения баккатина и/или производных баккатина, отличающийся тем, что 10-дезацетилбаккатин или производное 10-дезацетилбаккатина превращают в присутствии выделенного фермента и донора ацетильной группы, причем в качестве фермента используют 10-гидрокситаксо-О-ацетилтрансферазу, выделенную из Taxus chinensis, характеризующуюся следующими свойствами: субстратная специфичность; ацетилирует 10-дезацетилбаккатин-Ш селективно в положении 10 в присутствии донора ацетильной группы, в особенности ацетил-КоА; молекулярная масса; 70-72 кДа при определении методом электрофореза в полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия; изоэлектрическая точка; при рН 5,4 до 5,8; константа Михаэлиса-Ментена; Км 55-65 мкМ для ацетил-КоА; рН-оптимум; от 5 до 11 (в Трис буфере при 35°С в течение 25 мин, субстрат 10-дезацитилтаксоюнаннин). 2. Способ по п.1, отличающийся тем, что баккатин-Ш получают из 10-дезацетилбаккатина-Ш. 3. Способ по п.1, отличающийся тем, что 14-гидроксибаккатин-Ш получают из 14-гидрокси-10-дезацетилбаккатина-Ш. 4. Способ по п.1, отличающийся тем, что таксоюнаннин С получают из 10-дезацетилтаксоюнаннина С. 5. Способ по любому из пп.1-4, отличающийся тем, что превращение осуществляют в присутствии ацетил-КоА в качестве донора ацетильной группы. 6. 10-гидрокситаксо-О-ацетилтрансфераза, выделенная из Taxus chinensis, характеризующаяся следующими свойствами: субстратная специфичность; ацетилирует 10-дезацетилбаккатин-Ш селективно в положении 10 в присутствии донора ацетильной группы, в особенности ацетил-КоА; молекулярная масса; 70-72 кДа при определении методом электрофореза в полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия; изоэлектрическая точка; при рН 5,4 до 5,8; константа Михаэлиса-Ментена; Км 55-65 мкМ для ацетил-КоА; рН-оптимум; от 5 до 11 (в Трис буфере при 35°С в течение 25 мин, субстрат 10-дезацитилтаксоюнаннин). 7. Способ получения фермента по п.6, отличающийся тем, что его выделяют из клеточной культуры Taxus chinensis путем очистки и после каждой очистки устанавливают фракции, в которых находится фермент, добавляя 10-дезацетилбаккатин или производное 10-дезацетилбаккатина и донор ацетильной группы и обнаруживают образовавшийся продукт ацетилирования. 8. Способ по п.7, отличающийся тем, что способы очистки включают использование HighQ-колонки. 9. Способ по п.7 или 8, отличающийся тем, что для обнаружения содержащих фермент фракций используют 10-дезацетилбаккатин-Ш или 10-дезацетилтаксоюнаннин С. 10. Способ по любому из пп.7-9, отличающийся тем, что используют ацетил-КоА в качестве донора ацетильной группы. 11. Способ по любому из пп.7-10, отличающийся тем, что обнаружение образовавшегося продукта ацетилирования осуществляют путем радиоактивного мечения. 12. Способ по любому из пп.7-10, отличающийся тем, что обнаружение образовавшегося продукта ацетилирования осуществляют путем мечения с помощью тяжелого изотопа. 13. Способ получения таксола и/или производных таксола, отличающийся тем, что сначала получают баккатин или производное баккатина по любому из пп.1-5 и его путем этерификации гидроксильной группы в положении 13 производных баккатина с помощью пригодной кислоты превращают в таксол или производное таксола. РИСУНКИ
|
||||||||||||||||||||||||||
