Патент на изобретение №2218411

(54) СПОСОБ ОБНАРУЖЕНИЯ ПАТОГЕННЫХ МИКРООРГАНИЗМОВ В ОБЪЕКТАХ ВНЕШНЕЙ СРЕДЫ

(57) Реферат:

Изобретение относится к микробиологии и может быть использовано при выявлении патогенных микроорганизмов при их низкой концентрации в объектах внешней среды. Способ повышает чувствительность и специфичность обнаружения патогенных микроорганизмов в объектах внешней среды, упрощает анализ и заключается в использовании алюмосиликатных магноимммуносорбентов и хемилюминесцентного иммунного анализа.

Изобретение относится к микробиологии и может быть использовано при выявлении патогенных микроорганизмов при их низких концентрациях в объектах внешней среды.

Трудности выявления патогенных микроорганизмов в объектах внешней среды (почва, вода, пищевые продукты и т.д.) обусловлены их низкой концентрацией в пробах и наличием посторонней микрофлоры.

Применение традиционных лабораторных методов требует длительных манипуляций по выращиванию и выделению чистой культуры. Тем не менее, специфичность и чувствительность методов выявления патогенных микроорганизмов оставляет желать лучшего.

С развитием разработок по получению и использованию в микробиологии магноиммуносорбентов (МИС) значительно расширились возможности выделения патогенных микроорганизмов из объектов внешней среды путем их селективного концентрирования на поверхности МИС.

Известен набор устройств и приспособлений для различных манипуляций с магноиммуносорбентами: для забора, транспортировки и хранения проб, отделения магноиммуносорбента от жидкой фазы, для проведения иммунохимического анализа [Пат. РФ 2098828, G 01 N 33/553, С 12 М 1/00, 10.12.97. Бюл. 34].

Высокая эффективность использования МИС в эпиднадзоре за различными инфекционными заболеваниями обеспечивается за счет избирательного концентрирования инфекционного агента или его специфических антигенов, возможности максимального освобождения от посторонней микрофлоры путем многократных промываний без потери выделяемых микроорганизмов при исследовании сильно загрязненных проб (канализационные стоки, почва, фекалии и т.п.): высокой чувствительности, позволяющей обнаружить растворимые антигены и токсины в пределах 1 нг, а бактериальные клетки в количестве 110²-110³ м.к. в пробе, объем которой может достигать нескольких кубических метров жидкости; сокращения времени проведения анализов, связанного с ускорением манипуляций и исключением ряда этапов в ходе анализа (предварительное концентрирование, сенсибилизация планшет для ИФА, фиксирование препаратов для люммикроскопии и т. д.).

Представляется перспективным использование алюмосиликатных МИС, отличающихся простотой технологии получения, повышенной сорбционной емкостью и чувствительностью [Пат. РФ 2138813, G 01 N 33/543 от 27.09.99, Бюл. 27].

Детекция реакции “антиген антитело” (Аг-Ат) при селектировании микроорганизмов МИС осуществляют различными методами.

Известен способ выявления вируса гепатита А в объектах внешней среды, включающий селективное концентрирование вируса на МИС с помощью магнитных ловушек, расположенных в объектах внешней среды (водопроводные трубы, канализационные стоки, водоемы) с последующей детекцией наличия вируса иммуноферментным анализом (ИФА) [Пат. РФ 2065164, G 01 N 33/53 от 10.08.96, Бюл. 22].

Известен способ лабораторной диагностики возбудителей особо опасных инфекций (ООИ) (чума, холера, сибирская язва, бруцеллез) в объектах внешней среды, включающий избирательное концентрирование микроорганизмов на МИС с последующей постановкой полимеразной цепной реакции (ПЦР) [Пат. РФ N 2165081, G 01 N 33/53 от 10.04.01, Бюл. N 10]. Метод генной диагностики позволяет выявить несколько сотен м.к. в неограниченном объеме исследуемой пробы и идентифицировать инфекционный агент на уровне ДНК. Однако проведение ПЦР дорого, требует специальных помещений, оборудования и приспособлений.

Выбор метода лабораторной диагностики обуславливается такими факторами как экспрессность, чувствительность, простота исполнения. Сравнительный анализ современных методов, таких как метод флюоресцирующих антител (МФА), ИФА, хемилюминесцентный иммунный анализ (ХЛИА), радиоиммунный анализ (РИА), свидетельствует о том, что все эти методы являются достаточно экспрессными, самые чувствительные из них – ХЛИА и РИА.

Недостатки РИА, связанные с быстрым распадом меченых реагентов, необходимостью применения специальных мер по технике безопасности при работе с радиоактивными изотонами, высокой стоимостью регистрирующей аппаратуры, сдерживают широкое распространение метода. ХЛИА с развитием аппаратурной базы становится альтернативным РИА-методом.

Разновидностью люминесценции является хемилюминесцентная реакция, нашедшая применение в диагностике и индикации различных микроорганизмов и их токсинов. Хемилюминесцентными называют химические реакции, при которых вещества переходят в возбужденное состояние, а затем высвобождают накопленную энергию в виде эмиссии света. Применительно к микробиологическим исследованиям один из компонентов специфической реакции “антиген-антитело” конъюгируют (метят) маркером, участвующим в последующем в реакции хемилюминесценции.

В качестве таких маркеров используют гемин, пероксидазу, глюкозооксидазу и ряд других ферментов и веществ, способных взаимодействовать с соответствующими флюорогенными субстратами, среди которых чаще применяют люминол (5-амино-2,3-дигидрофталазин-1,4-дион) или их производные. В ряде случаев антиген или антитело метят непосредственно флюорогенным маркером, например люминолом.

Наиболее близким к заявляемому по назначению является хемилюминесцентный иммунный анализ (ХЛИА) для диагностики опасных инфекций [Л.Ф. Зыкин, А.Т. Яковлев. Очерки по лабораторной диагностике опасных инфекций, изд-во Саратовского университета, 1993, с.29-34.]
Способ осуществляется следующим образом: вначале сенсибилизируют лунки пластиковых планшетов соответствующими антителами (иммуноглобулинами), затем туда вносят исследуемые пробы. При наличии в пробе искомого антигена (микроорганизма) он иммобилизуется на поверхности лунки за счет реакции “антиген-антитело”. После отмывания лунок от несвязавшихся компонентов реакции туда вносят соответствующий иммунопероксидазный конъюгат, который фиксируется на антигене. Удалив промыванием несвязавшиеся компоненты реакции, в лунки вносят флюорогенный субстрат – люминол, благодаря которому регистрируется в виде эмиссии света высвобождающаяся в щелочной среде в присутствии перекиси водорода энергия из пероксидазы. Хемилюминесцентные реакции регистрируют любыми приборами, чувствительными к эмиссии видимого света, используя для этого сцинциллеционные счетчики или люминометры [Биотехнология, иммунология и биохимия особо опасных инфекций, Саратов, 1989, с.3-9]. При этом данные реакции не чувствительны к мутности, так как приборы регистрируют общий испускаемый свет независимо от его рассеивания. Время измерения этих реакций составляет несколько секунд, так как свет испускается в виде коротких вспышек, протекающих за время перемешивания реагентов. Когда хемилюминесценция используется для регистрации ферментных реакций, световая эмиссия непрерывно возрастает, так что чувствительность диагностической системы может быть измерена в зависимости от времени инкубации. Чувствительность хемилюминесцентной реакции может достигать 10²-10³ м.т./ мл.

Недостатком способа является его непригодность для исследования объектов внешней среды: почвы, воды, смывов и т.д. из-за серьезных фоновых помех; необходимость использования дорогостоящих и труднодоступных полистироловых микропланшет и потеря времени на их сенсибилизацию; исследование ограниченных объемов проб при концентрации в них микроорганизмов более 10²-10³ м.т./ мл.

Цель предлагаемого изобретения заключается в повышении специфической чувствительности обнаружения патогенных микроорганизмов при их низкой концентрации в пробе, возможности забора проб в неограниченных объемах из объектов внешней среды и исследовании проб с высокой степенью загрязненности при относительной простоте, производительности, возможности полной автоматизации исследования, упрощении анализа.

Технический результат заявляемого способа достигается тем, что патогенные микроорганизмы из объектов внешней среды селективно концентрируются на МИС с последующей детекцией реакции “антиген-антитело” хемилюминесцентным иммунным анализом, при этом реакцию ставят в стеклянных пробирках.

По отношению к прототипу заявляемый способ имеет следующие отличительные признаки: вместо полистероловых пробирок (планшет, кювет) используют магноиммуносорбенты, при этом:
а) у магноиммуносорбентов (МИС) большая удельная поверхность и соответственно выше емкость сорбции антител;
б) при использовании МИС эффективнее отмывка от несвязавшихся компонентов;
в) магноиммуносорбенты (МИС) инертны в реакции хемилюминесценции и не мешают прохождению реакции;
г) при использовании МИС повышается чувствительность метода хемилюминесценции;
д) МИС (в отличие от полистероловых планшетов) позволяют проводить исследование проб с высокой степенью загрязненности;
с) объем исследуемых проб при использовании МИС практически не ограничен.

Следовательно, использование МИС для селектирования микроорганизмов обусловлено тем, что они обладают возможностью исследования проб в неограниченных объемах, повышенными по сравнению с полистероловыми планшетами адгезивными свойствами и специфической сорбционной емкостью, что обеспечивает повышение специфической чувствительности иммунного анализа.

Использование ХЛИА для детекции реакции “антиген-антитело” обеспечивает доступность и простоту проведения высокочувствительного анализа. Использование в качестве твердой фазы магносорбентов исключает необходимость иммунной сенсибилизации планшет и создает возможность использования для постановки реакции стеклянных пробирок, что упрощает и удешевляет анализ.

Возможность практического использования заявляемого способа иллюстрируется примерами его конкретного выполнения.

Пример 1. Садовую почву (50-100 г), контаминированную B.abortus 544 в разведении 110⁹ м.к./мл суспендировали в 500 мл физиологического раствора. Для проведения селективного концентрирования суспензию пропускали через специальное устройство с магноиммуносорбентом (Свидетельство 10261 на полезную модель “Установка для микробиологического мониторинга суспензий типа “твердые частицы в воде, например, почвенные” от 16.06.1999 г.). Магносорбент снимали с ловушек, помещали в пробирки, добавляли 100 мкл бруцеллезного пероксидазного конъюгата в разведении 1: 200. Инкубировали 30-60 мин при 37^oС, отмывали ФСБ 4 раза с последней отмывкой дистиллированной водой. Добавляли 50 мкл люминола в разведении 1:100 и 50 мл перекиси водорода в разведении 110⁴. Результаты учитывали на люминомере ЛКБ 1250. Параллельно ставили положительный и отрицательный контроли. Чувствительность анализа составила 510¹-110² м.к./мл.

Аналогично были проведены испытания с антигенами Br.melitensis 16-М, Br. suis 1330, Br. ovis 716, 704, Br.canis H-966 с использованием МИС для S- и SR-форм возбудителя. Чувствительность анализа при обнаружении бруцеллезного антигена во всех случаях была не ниже 510¹-110² м.к./мл.

Пример 2. Суспензию почвы, контаминированную Fr. Tularensis Schu в разведениях от 110⁹ до 110¹ м.к./мл и суспендированную в 500 мл физиологического раствора, исследовали также с использованием вышеуказанной установки для микробиологического мониторинга суспензий. При прохождении жидкости из первого сосуда с разведением антигена 110⁹ м.к./мл магносорбент после контакта с пробой тщательно промывали на этом же устройстве, пропуская десятикратный (относительно суспензии пробы) объем физиологического раствора. Туляремийным МИС собирали в пробирку и заменяли новым, систему промывали и пропускали через ее пробы с более низкими концентрациями туляремийного антигена (110⁸-110¹ м. к. /мл). Собранный туляремийный МИС трижды отмывали ФСБ и во все пробирки добавляли 100 мкл туляремийного пероксидазного конъюгата в разведении 1:200. Инкубировали 30 мин при температуре 37^oС, отмывали ФСБ 4 раза, с последней отмывкой дистиллированной водой. Добавляли 50 мкл люминола в разведении 1:100 и 50 мкл перекиси водорода в разведении 1:10⁴. Результаты учитывали на люминометре ЛКБ 1250. Параллельно ставили положительный и отрицательный контроли. Чувствительность анализа при обнаружении туляремийного антигена составила 510¹-110²м.к./мл.

Таким образом, заявляемый способ имеет явные преимущества перед известными аналогами по специфической чувствительности обнаружения патогенных микроорганизмов, а также простоте и скорости проведения анализа, что дает основание для целесообразности его широкого применения в микробиологической практике.

Формула изобретения

Способ обнаружения патогенных микроорганизмов в объектах внешней среды, включающий их селективное концентрирование на магноиммуносорбентах с последующей детекцией реакции “антиген-антитело”, отличающийся тем, что для детекции патогена в сильно загрязненных пробах неограниченного объема с его низкой концентрацией применяется прямой хемилюминесцентный иммунный анализ с предварительным избирательным концентрированием антигена на аффинном сорбенте с магнитными свойствами.

MM4A Досрочное прекращение действия патента Российской Федерации на изобретение из-за неуплаты в установленный срок пошлины за поддержание патента в силе

Дата прекращения действия патента: 28.12.2003

Извещение опубликовано: 27.07.2005 БИ: 21/2005