Патент на изобретение №2218094

(54) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ РИСКА РАЗВИТИЯ ФИБРОЗНЫХ ИЗМЕНЕНИЙ В ЛЕГКИХ И ПЕЧЕНИ

(57) Реферат:

Изобретение относится к медицине и может быть использовано для определения риска развития фиброзных изменений в легких и печени. Проводят одновременно две полимеразные цепные реакции с тремя парами разных праймеров на маркерный ген гормона роста (МГГР), на S- и Z-аллели гена ₁-антитрипсина. Первую полимеразную цепную реакцию проводят с использованием праймера на МГГР, на мутантную S-аллель гена ₁-антитрипсина и мутантную Z-аллель гена ₁-антитрипсина. Вторую полимеразную цепную реакцию проводят с использованием праймера на МГГР и двух праймеров на нормальные S- и Z-аллели гена ₁-антитрипсина. Далее проводят гель-электрофорез полученных продуктов этих двух полимеразных цепных реакций и диагностируют наличие или отсутствие в геноме человека мутации нуклиатидных звеньев по S- и Z-аллелям гена ₁-антитрипсина как в гомозиготном, так и в гетерозиготном варианте. В случае отсутствия мутации нуклиатидных звеньев по S- и Z-аллелям определяют менее 20% риска развития фиброзных изменений в легких и печени. При наличии гетерозиготной мутации только по S-аллели – 20-50% риска. При наличии гетерозиготной мутации только по Z-аллели – 50-80% риска, а при наличии гомозиготной мутации одновременно и по S-, и по Z-аллелям – более 80% риска. Способ позволяет повысить эффективность определения риска развития фиброзных изменений в легких и печени. 2 ил.

Изобретение относится к области медицины и может быть использовано для выявления генетически обусловленного риска развития и прогнозирования фиброзных изменений в легких и печени.

Патогенетические механизмы развития фиброзных процессов связаны с функционированием протеиназно-ингибиторной системы. Протеиназы макрофагального, лейкоцитарного, бактериального происхождения, выделенные клетками во время воспалительных процессов, могут вести к деструкции коллагеновых и эластиновых структур, способствуя развитию фиброзных изменений в печени и легких.

К важнейшим физиологическим регуляторам протеолиза относятся ингибиторы, среди которых универсальным является ₁-антитрипсин. Он обладает большим полиморфизмом. Нормальный аллель обозначают РIМ (protease inhibitor). Наибольшее диагностическое значение имеют варианты Z и S, поскольку именно они определяют существенное снижение уровня ₁-антитрипсина.

Генодиагностические способы исследования обладают высокой чувствительностью и специфичностью, а также возможностью автоматизации их исполнения. Метод аллель-специфичной полимеразной цепной реакции (ПЦР) (другое название – PCR sequence specific priming (PCR-SSP) – “полимеразной цепной реакции с последовательность-специфичным праймированием”) основан на возможности идентификации точечных нуклеотидных замен в ДНК путем применения праймеров, 3′-конец которых соответствует проверяемой точке генома. При этом продукт полимеразной цепной реакции образуется лишь в случае строгой комплементарности растущего конца праймера, что позволяет точно определить наличие или отсутствие определяемой мутации путем обычного электрофореза продуктов полимеразной цепной реакции в агарозном геле с бромистым этидием.

Известны способы диагностики риска развития фиброзных изменений в легких и в печени по количественному уровню ₁-антитрипсина в плазме крови (Г.А. Яровая, В.Л. Доценко. Определение активности ₁-антитрипсина и ₂-макроглобулина в плазме крови человека унифицированным энзиматическим методом. Методы клинической биохимии, М., 1982, с. 22-26) и по фенотипам ₁

Однако перечисленные методы имеют ряд недостатков.

По данным эпидемиологических исследований в 90% случаев истинный дефицит, который может быть связан с наличием Z- и S-мутаций, не идентифицируют при рутинном количественном определении уровня ₁

При наличии воспалительного процесса гетерозиготы MZ типа и MS типа дают умеренное увеличение уровня ₁-антитрипсина, что также снижает достоверность результатов.

К недостаткам второго способа диагностики риска развития фиброзных изменений в легких и в печени относится необходимость использования дорогостоящих реактивов – амфолинов. Кроме того, этот метод позволяет определить наличие фенотипа белка PIS или PIZ, а не мутации на уровне замены нуклеотида в молекуле ДНК.

Наиболее близким по технической сущности, достигаемому эффекту к заявленному способу и выбранным в качестве прототипа является способ определения S- и Z-мутаций типа ₁-антитрипсина методом полимеразной цепной реакции с последующим рестриктазным расщеплением, который может быть использован для определения степени риска и прогнозирования фиброзных изменений в легких и печени путем диагностики Z- и S-мутаций гена ₁-антитрипсина при исследовании суммарной ДНК крови человека (G. Lucotte and R. Sesboue. Polymerase chain reaction detection of S and Z alpha-1-antitrypsin variants by duplex PCR assay. Molecular and Cellular Probes, 1999, v.13, p.398-391).

Недостатком данного способа является то, что этот сложный и дорогой способ анализа требует дополнительной стадии рестриктазного расщепления и дорогостоящих реактивов. Различие длин фрагментов-сигналов нормальных и мутантных аллелей в прототипе очень невелико (20 или 21 нуклеотидные последовательности). Более того, из-за особенностей прототипа это различие должно быть меньше длины праймера, то есть увеличить его для удобства восприятия результата затруднительно. В прототипе предлагается неоправданно большой объем смеси полимеразной цепной реакции (100 мкл, в патентуемом изобретении – 20 мкл) и длительный процесс полимеразной цепной реакции (соответственно более 2,5 ч и 1,5 ч).

Задачей настоящего изобретения является упрощение способа определения риска развития и прогнозирования фиброзных изменений в легких и печени и повышение степени его достоверности.

Указанная задача достигается тем, что в известном способе определения риска развития и прогнозирования фиброзных изменений в легких и печени путем диагностики Z- и S-мутаций гена ₁-антитрипсина при исследовании суммарной ДНК крови человека, отличающемся тем, что проводят одновременно две полимеразные цепные реакции с тремя парами праймеров на маркерный ген гормона роста, на S- и Z- аллели гена ₁-антитрипсина, при этом первую полимеразную цепную реакцию проводят с использованием праймеров на маркерный ген гормона роста, на мутантную S-аллель гена ₁-антитрипсина и на мутантную Z-аллель гена ₁-антитрипсина, а вторую полимеразную цепную реакцию проводят с использованием праймера на маркерный ген гормона роста и двух праймеров на нормальные S- и Z-аллели гена ₁-антитрипсина, далее проводят гель-электрофорез полученных продуктов этих двух полимеразных цепных реакций и определяют наличие или отсутствие в геноме человека S- и Z-мутаций гена ₁-антитрипсина как в гомозиготном, так и в гетерозиготном варианте, при этом в случае отсутствия мутации нуклеотидных звеньев по S- и Z-аллелям риск развития фиброзных изменений в легких и в печени может составлять менее 20% (причиной в этом случае могут служить вредные производственные и экологические факторы, вредные привычки – курение), при наличии гетерозиготной мутации в точке S – 20-50%, в точек Z – риск развития фиброзных изменений в легких и печени соответствует (50-80)%, при наличии гомозиготной мутации одновременно и по S-, и по Z-аллелям определяют более 80% риска развития фиброзных изменений в легких и печени.

Техническим результатом изобретения является то, что предлагаемая совокупность приемов позволяет упростить способ определения риска развития фиброзных изменений в легких и печени и повысить степень его достоверности.

Проведенные исследования по патентным и научно-техническим информационным источникам показали, что предлагаемый способ неизвестен и не следует явным образом из изученного уровня техники, т.е. соответствует критериям “новизна” и “изобретательский уровень”.

Предлагаемый способ может быть применен в пульмонологии, обшей терапии, в медицине труда, в экологии человека, в педиатрии, в любой диагностической лаборатории, укомплектованной типовым оборудованием, выпускаемым отечественной или зарубежной промышленностью, при проведении первичных и периодических медицинских осмотров у промышленных рабочих в медсанчастях.

Таким образом, заявленный способ является доступным, а следовательно, практически применимым.

Предлагаемый способ основан на определении S- и Z- мутаций гена ₁-антитрипсина. Для этого используют систему из двух пар аллель-специфичных праймеров (на S- и Z-мутации соответственно) на основе последовательности указанного гена из ГенБанка EMBL (HSA1ATZ, ACJ02619).

Для контроля выделения ДНК и прохождения полимеразной цепной реакции используют те же праймеры на маркерный ген гормона роста (HGH1 и HGH2), что и в указанном выше прототипе. Однако разработанная система выгодно отличается от прототипа возможностью определения двух мутаций в двух полимеразной цепной реакции вместо четырех, для чего были подобраны длины образующихся при полимеразной цепной реакции амплификонов.

На фиг. 1 представлена схема расположения в гене ₁-антитрипсина нуклеотидных замен, приводящих к S- и Z-мутациям, и праймеров (обозначены стрелками) для их выявления методом аллель-специфичной полимеразной цепной реакции. Длины амплификонов, образующихся при определении звена в точке 867 (S) и в точке 1100 (Z), заданы различными нуклеотидными последовательностями (146 и 245 нуклеотидные последовательности соответственно), что позволяет проводить полимеразную цепную реакцию с праймерами на обе мутации в одной пробирке.

На фиг. 2 представлена электрофореграмма продуктов полимеразной цепной реакции при определении S- и Z-мутаций у четырех пациентов А, В, С. Во всех случаях дорожка М соответствует анализу мутации (полимеразной цепной реакции с праймерами atsc, atsm, atzc, atzm, HGH1, HGH2), дорожка N – анализу нормы (полимеразной цепной реакции с праймерами atsc, atsn, atzc, atzn, HGH1, HGH2). Цифры справа указывают длину продуктов в нуклеотидной последовательности. Сигнал маркерного гена виден как фрагмент длиной 429 нуклеотидных последовательностей, сигналы по точке Z – 245 нуклеотидных последовательностей, сигналы по точке S – 146 нуклеотидных последовательностей.

Наличие во всех пробах сигнала маркерного гена подтверждает эффективность выделения ДНК и полимеразной цепной реакции. Сигналы аллель-специфичной полимеразной цепной реакции показывают, что у пациента С нуклеотидные звенья в точках Z и S соответствуют норме, пациент В гетерозиготен по Z и имеет норму по S, пациент А гомозиготен по Z и имеет норму по S.

Предлагаемый способ осуществляют следующим образом.

Из 100 мкл цельной крови пациента выделяют суммарную ДНК однопробирочным методом с использованием набора фирмы “ГенТест” – РНК/ДНК – экстракция (ТУ 9398-423-47621885-00) в объеме 20 мкл.

Полученный препарат ДНК вводят по 2 мкл в каждую из двух полимеразной цепной реакции – М (анализ на мутации) и N (анализ на норму). Обе реакции проводят в 20 мкл стандартного буфера для полимеразной цепной реакции, содержащего 1 единицу активности Taq-полимеразы. В реакцию М вводят по 5 пмоль праймеров atsc, atsm, atzc, atzm и по 3 пмоль праймеров HGH1, HGH2. В реакцию N вводят по 5 пмоль праймеров atsc, atsn, atzc, atzn и по 3 пмоль праймеров HGH1, HGH2.

Условия проведения полимеразной цепной реакции: 94^oС 3 мин; далее 35 циклов: 92^oС 30 с, 60^oС 30 с, 72^oС 30 с; в конце 72^oС 3 мин.

Гель-электрофореграмма продуктов приведена на фиг.2.

Наличие во всех пробах сигнала маркерного гена подтверждает эффективность выделения ДНК и полимеразной цепной реакции.

Сигналы аллель-специфичной полимеразной цепной реакции показывают, что возможны различные результаты анализа:
– нуклеотидные звенья в точках Z и S соответствуют норме;
– нуклеотидные звенья в точке Z соответствуют норме, а в точке S наблюдается замена нуклеотидного звена (PIMS);
– нуклеотидные звенья в точке S соответствуют норме, а в точке Z наблюдается замена нуклеотидного звена (PIMZ);
– имеется замена нуклеотидного звена в точке Z (PIMZ) и в точке S (PIMS);
– изменения нуклеотидных звеньев в точке Z по двум аллелям (гомозиготный вариант PIZZ), а в точке S нуклеотидные звенья соответствуют норме;
– изменения нуклеотидных звеньев в точке S по двум аллелям (гомозиготный вариант P1SS), а в точке Z нуклеотидные звенья соответствуют норме;
– имеется замена нуклеотидного звена в точке Z по двум аллелям (гомозиготный вариант PIZZ) и в точке S по двум аллелям (гомозиготный вариант PISS).

В последнем случае можно говорить об отсутствии ₁-антитрипсина (PI-0), при этом очень большая вероятность развития ювенильного цирроза печени и раннего развития фиброзных процессов в легких.

При отсутствии мутации по S- и Z-аллелям нуклеотидные звенья соответствуют норме, т.е. количественный уровень ₁-антитрипсина соответствует физиологической норме, и пациент не имеет риска развития или предрасположенности к развитию фиброзных изменений в легких, например к развитию бронхолегочных заболеваний эмфиземы, бронхита пневмокониозов и бронхиальной астмы, или печени, например – цирроза.

При наличии гетерозиготной мутации только по S- или Z-аллелям пациент имеет 50-80% от общего количества ₁-антитрипсина и имеет соответствующий риск развития фиброзных изменений в легких и в печени.

При наличии гомозиготной мутации по S-аллелям пациент имеет 30-50% от общего уровня ₁-антитрипсина, а по Z аллелям – 10-20% либо его отсутствие. При этом другие белки берут на себя функцию ингибиторов протеиназ (гаптоглобин, ₂-макроглобулин), но их уровня недостаточно для компенсации ингибиторной активности и пациенты имеют высокую (более 80%) предрасположенность к развитию фиброзных изменений в легких и печени. Дополнительные факторы (курение, факторы окружающей и производственной среды) способствуют быстрому развитию фиброзных изменений в легких и печени. Гомозиготные мутации являются причиной развития ювенильного цирроза печени, в связи с чем диагностика мутаций имеет значение в педиатрической практике.

Воздействие дополнительных внешних факторов (курение, промышленные аэрозоли, частые инфекции), при наличии Z- и S-мутаций, увеличивает риск развития фиброзных изменений в легких и в печени.

Пример 1. Больная А., 60 лет.

Диагноз основной – хронический бронхит, выраженная эмфизема легких с обструкцией мелких бронхов и выраженным снижением ЖЕЛ, дыхательная недостаточность II степени по смешанному типу, фиброз печени с нарушением ее функции по данным биохимических исследований: гипербилирубинемия, повышение активности органоспецифических ферментов печени – ACT, АЛТ, ЛДГ, гамма-ГТП, щелочной фосфатазы. Электрофорез белков сыворотки крови – резкое снижение фракции ₁-глобулинов.

Диагноз сопутствующий – гипертоническая болезнь, хронический холецистит.

Рентгенологическое обследование выявило наличие выраженной эмфиземы легких.

Кровь больной исследовалась заявленным образом: из 100 мкл цельной крови выделена суммарная ДНК однопробирочным методом с использованием набора фирмы “ГенТест” – РНК/ДНК-экстракция (ТУ 9398-423-47621885-00).

Из полученного препарата ДНК (объемом 20 мкл) было введено по 2 мкл в каждую из двух полимеразной цепной реакции – М (анализ на мутации) и N (анализ на норму). Обе реакции проведены в 20 мкл стандартного буфера для полимеразной цепной реакции, содержащего 1 единицу активности Taq-полимеразы. В реакцию М вводилось по 5 пмоль праймеров atsc, atsm, atzc, atzm и по 3 пмоль праймеров HGH1, HGH2; в реакцию N вводилось по 5 пмоль праймеров atsc, atsn, atzc, atzn и по 3 пмоль праймеров HGH1, HGH2. Условия ПЦР: 94^oС 3 мин; далее 35 циклов: 92^oС 30 с, 60^oС 30 с, 72^oС 30 с; в конце 72^oС 3 мин. Сигналы аллель-специфичной полимеразной цепной реакции показывают, что у больной А. имеются изменения нуклеотидных звеньев в точке S по двум аллелям (гомозиготный вариант PISS), а в точке Z нуклеотидные звенья соответствуют норме (фиг.2, электрофореграмма А).

Вывод: у больной А. выявлен гомозиготный вариант мутации ZZ гена ₁-антитрипсин, свидетельствующий о резко выраженном дефиците указанного белка, что и явилось причиной фиброзных изменений в печени и в легочной ткани.

Пример 2. Больной В., 74 года, 27 лет работал в контакте с повышенными концентрациями кварцсодержащей пыли в литейном цехе.

Диагноз основной – силикоз, хронический бронхит. Регионарный пневмосклероз нижней доли справа. Двусторонний адгезивный плеврит. Эмфизема легких, дыхательная недостаточность II-III степени. Двусторонняя нейросенсорная тугоухость с легкой степенью снижения слуха.

Диагноз сопутствующий – гипертоническая болезнь II степени. Ишемическая болезнь сердца, стенокардия напряжения II ФК. Хроническая цереброваскулярная болезнь. Полисегментарный остеохондроз позвоночника, цервикобрахиалгия, люмбалгия. Ангиосклероз сетчатки. ОД – Незрелая возрастная катаракта. OS – Артифакия.

Рентгенологическое исследование выявило наличие силикоза, эмфиземы легких, двустороннего адгезивного плеврита, регионарного пневмосклероза нижней доли справа.

Электрофорез белков сыворотки крови – снижение фракции ₁-глобулинов.

Кровь больного исследовалась заявленным способом: из 100 мкл цельной крови выделена суммарная ДНК однопробирочным методом с использованием набора фирмы “ГенТест” – РНК/ДНК – экстракция (ТУ 9398-423-47621885-00). Из полученного препарата ДНК (объемом 20 мкл) было введено по 2 мкл в каждую из двух полимеразной цепной реакции – М (анализ на мутации) и N (анализ на норму). Обе реакции проведены в 20 мкл стандартного буфера для полимеразной цепной реакции, содержащего 1 единицу активности Taq-полимеразы. В реакцию М вводилось по 5 пмоль праймеров atsc, atsm, atzc, atzm и по 3 пмоль праймеров HGH1, HGH2; в реакцию N вводилось по 5 пмоль праймеров atsc, atsn, atzc, atzn и по 3 пмоль праймеров HGH1, HGH2. Условия полимеразной цепной реакции: 94^oС 3 мин; далее 35 циклов: 92^oС 30 с, 60^oС 30 с, 72^oС 30 с; в конце 72^oС 3 мин. Сигналы аллель-специфичной полимеразной цепной реакции показывают, что пациент В. имеет гетерозиготную мутацию нуклеотидного звена по Z и норму по S.

Вывод: больной имеет гетерозиготную Z мутацию ₁-антитрипсина, свидетельствующую о гипосекреции данного ингибитора – 50-80% от нормального уровня. При поступлении на работу, связанную с воздействием промышленных аэрозолей, больной В. имел высокий риск развития бронхолегочной патологии даже при маленьком стаже работы.

Пример 3. Пациентка С.

Диагноз основной – практически здорова. Биохимический анализ крови в пределах физиологических колебаний.

Кровь пациентки исследовалась заявленным способом: из 100 мкл цельной крови выделена суммарная ДНК однопробирочным методом с использованием набора фирмы “ГенТест” – РНК/ДНК – экстракция (ТУ 9398-423-47621885-00). Из полученного препарата ДНК (объемом 20 мкл) было введено по 2 мкл в каждую из двух полимеразной цепной реакции – М (анализ на мутации) и N (анализ на норму). Обе реакции проведены в 20 мкл стандартного буфера для полимеразной цепной реакции, содержащего 1 единицу активности Taq-полимеразы. В реакцию М вводилось по 5 пмоль праймеров atsc, atsm, atzc, atzm и по 3 пмоль праймеров HGH1, HGH2; в реакцию N вводилось по 5 пмоль праймеров atsc, atsn, atzc, atzn и по 3 пмоль праймеров HGH1, HGH2. Условия полимеразной цепной реакции: 94^oС 3 мин; далее 35 циклов: 92^oС 30 с, 60^oС 30 с, 72^oС 30 с; в конце 72^oС 3 мин. Сигналы аллель-специфичной полимеразной цепной реакции показывают, что у пациента С нуклеотидные звенья в точках Z и S соответствуют норме (фиг.2, электрофореграмма С).

Предлагаемый способ позволяет упростить процесс определения риска развития и прогнозирования фиброзных изменений в печени (с развитием цирроза) и легких, а также бронхолегочной системе (эмфиземы, бронхита, пневмокониозов), повысить степень их достоверности.

В отличие от прототипа, в предлагаемом способе отсутствует длительная (3 ч) стадия рестриктазного расщепления, которая, кроме того, требует использования довольно больших количеств (40 единиц активности на 2 мутации) дорогостоящей рестриктазы, а также подбора условий для полноты расщепления. Несоблюдение или нарушение последнего весьма вероятно в ходе работы, и в этом случае сильно осложняется интерпретация результатов.

Для полимеразной цепной реакции – анализа с использованием заявленной системы подходит препарат ДНК из крови, полученный любым из известных способов; объем крови 100 мкл достаточен для анализа.

Предложенный способ также позволяет с высокой точностью проводить дифференциальную диагностику заболеваний с установлением ведущего этиологического фактора. В медицине труда предложенный способ позволит выявлять индивидуальную предрасположенность к развитию бронхолегочных заболеваний у лиц, работающих в контакте с промышленными аэрозолями, и разработать новую систему профилактики, направленную на повышение эффективности решения вопросов профессиональной ориентации, проведения предварительных при поступлении на работу и периодических медицинских осмотров, а также решения вопросов реабилитации и рационального трудоустройства.

Высокая чувствительность и специфичность предлагаемого способа, автоматизация исполнения, генетическая детерминированность мутации гена ₁-антитрипсина (это позволяет проводить исследование у пациентов однократно), возможность проведения скрининга – дают возможность рекомендовать его для широкого применения в практике общей пульмонологии, терапии, педиатрии, в медицине труда при проведении первичных и периодических медицинских осмотров, в зонах экологического бедствия.

Использование предлагаемого способа позволит разрабатывать профилактические мероприятия по предупреждению развития бронхолегочной патологии и фиброзных процессов в печени с учетом индивидуальных особенностей организма, своевременно оценивать значение различных факторов внешней среды на здоровье отдельного человека.

Способ определения риска развития фиброзных изменений в легких и печени может найти широкое применение в общей пульмонологии, в терапии, в педиатрии, в медицине труда и экологии человека.

Формула изобретения

Способ определения риска развития фиброзных изменений в легких и печени путем диагностики Z и S мутаций гена ₁-антитрипсина при исследовании суммарной ДНК крови человека, отличающийся тем, что проводят одновременно две полимеразные цепные реакции с тремя парами разных праймеров на маркерный ген гормона роста, на S и Z аллели гена ₁-антитрипсина, при этом первую полимеразную цепную реакцию проводят с использованием праймера на маркерный ген гормона роста, на мутантную S аллель гена ₁-антитрипсина и мутантную Z аллель гена ₁-антитрипсина, а вторую полимеразную цепную реакцию проводят с использованием праймера на маркерный ген гормона роста и двух праймеров на нормальные S и Z аллели гена ₁-антитрипсина, далее проводят гель – электрофорез полученных продуктов этих двух полимеразных цепных реакций и диагностируют наличие или отсутствие в геноме человека мутации нуклиатидных звеньев по S и Z аллелям гена ₁-антитрипсина как в гомозиготном, так и в гетерозиготном варианте, при этом в случае отсутствия мутации нуклиатидных звеньев по S и Z аллелям определяют менее 20% риска развития фиброзных изменений в легких и печени, при наличии гетерозиготной мутации только по S аллели определяют 20-50% риска развития фиброзных изменений в легких и печени, при наличии гетерозиготной мутации только по Z аллели определяют наличие 50-80% риска развития фиброзных изменений в легких и печени, а при наличии гомозиготной мутации одновременно и по S, и по Z аллелям определяют наличие более 80% риска развития фиброзных изменений в легких и печени.

РИСУНКИ

MM4A – Досрочное прекращение действия патента СССР или патента Российской Федерации на изобретение из-за неуплаты в установленный срок пошлины за поддержание патента в силе

Дата прекращения действия патента: 03.04.2007

Извещение опубликовано: 10.03.2008 БИ: 07/2008

NF4A Восстановление действия патента СССР или патента Российской Федерации на изобретение

Дата, с которой действие патента восстановлено: 20.05.2008

Извещение опубликовано: 20.05.2008 БИ: 14/2008