Патент на изобретение №2217753

(54) СПОСОБ ДИАГНОСТИКИ ЭНДОГЕННОЙ ИНТОКСИКАЦИИ ПРИ ОЖОГАХ В ЭКСПЕРИМЕНТЕ

(57) Реферат:

Изобретение относится к медицине. Способ характеризуется тем, что у белых беспородных крыс, подвергшихся ожогу, в гемолизате эритроцитов определяют активность фермента альдегиддегидрогеназы спектрофотометрически, при наличии активности указанного фермента ниже нормы делают вывод о наличии токсинов в гемолизате эритроцитов. Изобретение позволяет быстро и просто выявить токсичность крови. 2 табл.

Предлагаемое изобретение относится к медицине, в частности к способам диагностики эндогенной интоксикации при ожогах в эксперименте.

В качестве прототипа выбран способ диагностики эндогенной интоксикации при ожогах в эксперименте, заключающийся в заборе крови, введении сыворотки крови здоровым животным с предварительно блокированной ретикулоэндотелиальной системой и количественной оценке степени токсичности крови обожженных крыс по проценту летальности в течение 72 часов (Федоров Н.А., Мовшев Б.Е., Недошивина P.В., Корякина И.К. Ожоговая аутоинтоксикация. Пути иммунологического преодоления. – М: Медицина, 1985. – с. 30-31).

Однако известный способ является длительным, требует для своего выполнения подбора двух биологических объектов: один – в качестве источника токсинов, другой – в качестве биотест-объекта, а также дополнительной операции – блокирования ретикулоэндотелиальной системы.

Задача предлагаемого изобретения – раннее выявление токсичности крови, упрощение и ускорение способа.

Поставленная задача решается за счет того, что в способе диагностики эндогенной интоксикации при ожогах в эксперименте, включающем забор крови, в гемолизате эритроцитов определяют активность фермента – альдегиддегидрогеназы (АльДГ) и, если его активность ниже нормы, делают вывод о токсичности крови.

Исследования выполнены на 20 беспородных половозрелых белых крысах обоего пола массой 200-240 г. Контрольная группа представлена животными, не подвергшимися ожогу. Способ диагностики эндогенной интоксикации при ожогах в эксперименте осуществляют следующим образом. Животным опытной группы под тиопенталовым наркозом (30 мг/кг массы) наносят ожог пламенем на 10% поверхности тела. Через час после ожога после декапитации у крыс собирают вытекающую из шейных сосудов кровь, стабилизируют ее цитратом натрия (3,8%) в соотношении 9: 1, центрифугируют 10 мин при 3000 об/мин, отделяют плазму от эритроцитов. Эритроцитарную массу промывают в 5 мл физиологического раствора. После осаждения (10 мин при 3000 об/мин) удаляют физиологический раствор с 10-15% поверхностно расположенных эритроцитов. Отмытые эритроциты гемолизируют в дистиллированной воде в соотношении 1:40.

Затем 0,4 мл гемолизата эритроцитов смешивают с 2 мл реактива, содержащего 1 мл 0,5%-ного раствора сернокислой меди, приготовленного на 1%-ном растворе цитрата натрия, и 50 мл 2%-ного раствора карбоната натрия, приготовленного на 0,1 М натриевой щелочи, и оставляют при комнатной температуре на 10 мин. Добавляют 0,2 мл реактива Фолина-Чокальтеу и через 30-40 мин измеряют на спектрофотометре величину оптической плотности при 750 нм. По калибровочной кривой определяют концентрацию белка в мг. После этого в спектрофотометрическую кювету помещают 2,8 мл 0,1 М глицин-щелочного буфера (рН 10), 0,05 мл 18 мМ ацетальдегида, 0,1 мл 0,8 мМ окисленного никотинамидадениндинуклеотида (НАД). После добавления 0,05 мл гемолизата эритроцитов к находящимся в кювете остальным компонентам смеси содержимое кюветы (3 мл) быстро перемешивают и измеряют величину оптической плотности при 340 нм с интервалом 15 с в течение 1 минуты. Активность фермента (А, нмоль НАДН/мин мг белка) вычисляют по формуле

где Е₃₄₀ – величина оптической плотности, измеренной при 340 нм и рассчитанной следующим образом: Е₃₄₀=(Е₁–Е₂/2)+Е₂, где Е₁=Е_30”-E₀; Е₂=E_60”-E₀;
3 – объем пробы в кювете, в мл;
10⁹ – коэффициент пересчета моль в нмоль;
6,2210⁶ – коэффициент молярной экстинкции для восстановленного никотинамидадениндинуклеотида (НАДН);
t – время, в течение которого измеряют активность альдегиддегидрогензы, в мин;
b – количество белка в мг.

Если активность альдегиддегидрогеназы ниже нормы, то делают вывод о наличии токсинов в гемолизате эритроцитов.

Результаты исследований активности фермента представлены в таблице 1.

Пример конкретного выполнения исследования.

Беспородной белой крысе (самец массой 200 г, в таблице 1) наносят под тиопенталовым наркозом ожог пламенем на 10% поверхности тела. Через час собирают кровь из шейных сосудов и готовят гемолизат эритроцитов, 0,05 мл которого помещают в электрофотометрическую кювету к имеющимся там компонентам и измеряют величину оптической плотности при длине волны 340 нм (Е₃₄₀) в течение 1 минуты с интервалом 15 секунд (табл.2)
Рассчитывают величину оптической плотности при 340 нм за мин по формуле: Е₃₄₀= (Е₁–Е₂/2)+Е₂, где Е₁– величина оптической плотности, измеренная за 30 с, Е₂ – величина оптической плотности, измеренная за 1 мин. Таким образом, Е₃₄₀=(0,004-0,003)+0,006=0,007.

Затем в гемолизате определяют количество белка (b) по методу Лоури. Белок равен: 0,163 мг. После этого рассчитывают активность фермента – альдегиддегидрогеназы по формуле

где Е₃₄₀ – величина оптической плотности, измеренной при 340 нм за мин,
3 – объем пробы в кювете;
10⁹ – коэффициент пересчета моль в нмоль;
6,2210⁶ – коэффициент молярной экстинкции для восстановленного никотинамидадениндинуклеотида;
t – время, в течение которого измеряют активность фермента в мин;
b – количество белка в мг.

Таким образом,

что свидетельствует о снижении активности альдегиддегидрогеназы и тем самым о наличии токсинов в крови.

Способ диагностики эндогенной интоксикации при ожогах в эксперименте дает возможность раннего выявления токсинов в крови, способ простой и быстрый в исполнении, не требует дорогостоящего оборудования и большого количества биологического материала.

Формула изобретения

Способ диагонстики эндогенной интоксикации при ожоге в эксперименте путем забора крови, отличающийся тем, что в гемолизате эритроцитов определяют активность фермента – альдегиддегидрогеназы (АльДГ) и, если его активность ниже нормы, делают вывод о токсичности крови.

РИСУНКИ

MM4A Досрочное прекращение действия патента Российской Федерации на изобретение из-за неуплаты в установленный срок пошлины за поддержание патента в силе

Дата прекращения действия патента: 11.01.2004

Извещение опубликовано: 27.05.2006 БИ: 15/2006