Патент на изобретение №2215295

(54) СПОСОБ ВЫДЕЛЕНИЯ ФРАКЦИЙ ГЕТЕРОГЕННЫХ АНТИГЕНОВ, СХОДНЫХ МЕЖДУ АНТИГЕНАМИ МИКРООРГАНИЗМОВ РОДА BRUCELLA И ПАРЕНХИМАТОЗНЫМИ ТКАНЯМИ ЧЕЛОВЕКА

(57) Реферат:

Изобретение относится к области медицины и может быть использовано для диагностики различных заболеваний. Сущностью изобретения является выделение фракции гетерогенных антигенов, сходных между таковыми микроорганизмов рода Brucella и паренхиматозными тканями человека, при этом в качестве антигенов используют водно-солевой экстракт из паренхиматозных тканей человека, осуществляют контакт антигенов и иммуносорбента смешиванием суспензии иммуносорбента с антигенами с последующей инкубацией смеси, при этом отделение и диссоциацию гетерогенных антигенов проводят путем центрифугирования или фильтрации через бумажный фильтр. Техническим результатом является упрощение и ускорение выделения фракции гетерогенных антигенов.

Изобретение относится к медицине, может быть использовано в биотехнологии выделения антигенов из органов и тканей человека и животных, имеющих общие антигенные детерминанты с возбудителями особо опасных инфекций (ООИ).

Известно использование антигенов, экстрагированных из органов и тканей человека и животных в диагностике различных заболеваний.

Известен способ получения галактоцереброзидного антигена из ткани мозга быка, крысы или кролика путем экстракции липидов смесью хлороформ-метанол, отмывание экстракта от примесей и ганглиозидов, упаривание экстракта и растворение осадка липидов в кипящем этаноле. (А.с. СССР 1461465, А 61 К 39/00, оп. 28.02.89. Бюл. 8).

Антиген используют для определения антител к галактоцереброзиду в сыворотке крови.

Известен способ выделения раковоэмбрионального антигена путем экстракции опухолевой ткани хлорной кислотой с последующими ионообменной и гель-хроматографией и элюцией целевого продукта линейным градиентом концентрации хлористого натрия 0-0,1М в 0,01М натрий-фосфатном буфере рН 7,4. (А.с. СССР 1363562, А 61 К 39/00, оп. 23.03.92. Бюл. 11).

Известен способ получения иммобилизованного антигена из ткани сердечной мышцы на магносорбенте для определения антикардиальных антител у больных ревматизмом. (Пат. РФ 2056862, А 61 К 39/385, оп. 27.03.96. Бюл. 9).

Способ включает обработку тканей сердечной мышцы животного методом ультразвуковой дезинтеграции, выделение антигена с последующей его полимеризацией с акриламидом, метиленбисакриламидом и магнитным материалом.

Недостатком этих способов является низкая чистота и специфичность антигенов, что обусловлено переходом в экстракт различных примесей. Кроме того, известные способы сложны и трудоемки, требуют специального оборудования.

Способ основан на экспериментальных результатах, свидетельствующих о том, что иммунные сыворотки против эритроцитов человека реагируют в реакции преципитации с некоторыми штаммами Y.pestis (EV, EV-5, 231, Otten).

Способ осуществляется формированием иммунного комплекса антигенов из эритроцитов человека или животного и антимикробных антител, зафиксированных на твердофазном носителе путем контакта антигена и иммуносорбента с последующей отмывкой иммуносорбента от несвязавшихся антигенов и диссоциацией гетерогенного антигена элюирующим раствором.

Иммуносорбенты готовили полимеризацией полиакриламидного геля в присутствии иммунной сыворотки против Y.pestis, гель измельчали, промывали элюирующим 0,3М раствором роданида натрия и отмывали трис-НСl буфером с рН 7,5 до полного отсутствия белка. Отмытый гель смешивали с равным объемом набухшего в трис-НСl буфере сефадекса-G-25 и полученную смесь наносили на колонку. На колонку наносили антигенный препарат из эритроцитов человека.

После окончания перфузии колонку тщательно промывали трис-НСl буфером для удаления компонентов, не связавшихся с сорбентом. Элюцию осуществляли с помощью 3М роданида натрия. Элюировавший раствор диализовали против трис-НСl буфера с целью удаления ионов роданида натрия. Полученную фракцию концентрировали с использованием полиэтиленгликоля так, чтобы в 1 мл содержался 1 мг белка.

Недостатком способа является сложность и длительность процесса выделения фракции антигена, обусловленных необходимостью предварительного, перед экстракцией, лизирования клеточных стенок эритроцитов, а также формированием иммунного комплекса антиген-антитело на хроматографической колонке, при этом процесс перфузии продолжается более суток.

Длителен и сложен также процесс отмывки иммуносорбентов от несвязавшихся антигенов и диссоциации антигенов из иммунного комплекса.

Технической задачей заявляемого способа является упрощение и ускорение способа выделения фракции гетерогенных антигенов.

Технический результат достигается тем, что способ включает формирование иммунного комплекса из антигенов, в качестве которых используют водно-солевой экстракт из паренхиматозных органов человека и животных, и антимикробных антител, зафиксированных на твердофазном носителе, путем смешивания суспензии иммуносорбентов с водорастворимыми антигенами в соотношении 1:2-1: 3 с последующей инкубацией смеси, отмывку иммуносорбентов от несвязавшихся антигенов, диссоциацию фракции гетерогенных антигенов элюирующим раствором, при этом отделение не связавшихся с иммуносорбентом антигенов и диссоциацию гетерогенных антигенов проводят путем центрифугирования или фильтрации через бумажный фильтр.

По отношению к прототипу заявленный способ имеет следующие существенные отличительные признаки:
использование в качестве антигенов водно-солевого экстракта из паренхиматозных органов человека и животных, что упрощает выделение гетерогенных антигенов;
формирование иммунного комплекса путем смешивания суспензии иммуносорбентов с водорастворимыми антигенами с последующей инкубацией смеси, что упрощает и сокращает время формирования иммунного комплекса почти в 2 раза, а также упрощает процессы отмывки иммуносорбента и диссоциации гетерогенных антигенов, так как эти процессы осуществляют центрифугированием или фильтрованием; подкисление элюирующего раствора до рН 5,0-5,5, что интенсифицирует процесс диссоциации антигенов и антител, фиксированных на сорбенте. Более низкие значения величины рН вызывают денатурацию антигенов и антител, фиксированных на сорбенте.

Заявленные значения соотношения в смеси суспензии иммуносорбентов и антигенов, а также временные параметры инкубации смеси необходимы и достаточны для достижения формирования иммунного комплекса.

Иммуносорбенты готовили полимеризацией полиакриламидного геля в присутствии иммунных сывороток против водорастворимого антигена микроба, гель измельчали с последующим многократным отмыванием в буфере с рН 7,2-7,5. Отмывание прекращали, когда в промывных водах переставал обнаруживаться белок, определяемый спектрофотометрически при длине волны 280 нм, и затем соединяли с водорастворимыми антигенами, полученными методом водно-солевой экстракции из паренхиматозных органов человека и животных (печень, легкое, селезенка).

Суспензию иммуносорбента соединяли с водорастворимыми антигенами в соотношении 1:2-1:3. Инкубировали смесь при 37^oС в течение 2-2,5 ч, при комнатной температуре 4-4,5 ч, при ^oС – 6-6,5 ч. После инкубации проводили многократное отмывание в (ЗФР) с рН 7,2-7,5 с центрифугированием при 6000 об/мин в течение 10-15 мин, надосадок убирали, отмывание прекращали, когда в промывных водах переставал обнаруживаться белок, определяемый спектрофотометрически при длине волны 280 нм. Затем к осадку прибавляли диссоциирующий раствор, содержащий 3М роданистого калия с рН 5,0-5,5, опять центрифугировали тем же способом и проводили диализ надосадка от роданистого калия.

Возможность практического использования заявляемого способа иллюстрируется примером его конкретного выполнения.

Пример. Антигены нормальных тканей человека получают от трупов людей с группой крови 0 (l)Rh-, погибших от случайной травмы.

Печень измельчают ножницами, замораживают в предварительно охлажденном Х-пресс дезинтеграторе при минус (40-50)^oС, клетки разрушают на гидравлическом прессе при давлении 2000 кг/см². Затем проводят экстракцию 2,5% раствором хлорида натрия (NaCl) в соотношении 1:10 со стеклянными бусами на шуттель-аппарате в течение 18-20 ч, оставляют в холодильнике при температуре (42)^oС на 14-16 ч. Центрифугируют при 20000-22000 об/мин в течение 30-40 мин. Супернатант оставляют на холоду при температуре (42)^oС, осадок ресуспендируют в 2-3-х объемах 2,5% раствора NaCl и подвергают ультразвуковой дезинтеграции на холоду при частоте 22 кГц в течение 20-30 мин, затем центрифугируют вышеуказанным способом, супернатанты смешивают и проводят диализ против дистиллированной воды. Полученные антигены лиофильно высушивают и используют в работе.

Гипериммунные сыворотки получают, используя схему иммунизации путем последовательных инъекций водорастворимого комплексного антигена бруцелл с иммуномодулятором-феракрилом.

Иммуносорбенты готовят полимеризацией полиакриламидного геля, механически иммобилизуя в его решетчатую структуру (концентрация сополимеров реакции: общая концентрация (Т) полиакриламидного геля (ПААГ) составила 20%, а концентрация (С) поперечносшивающего агента – N,N’-метиленбисакриламида (БИС) составила 25%) иммуноглобулиновые фракции иммунных сывороток против комплексного бруцеллезного антигена, гель измельчают с последующим многократным отмыванием в забуференном физиологическом растворе (ЗФР) с рН 7,20,2. Отмывание прекращают, когда в промывных водах перестает обнаруживаться белок, определяемый спектрофотометрически при длине волны 280 нм, и затем соединяют с водорастворимыми антигенами из паренхиматозных органов человека и животных (печень, легкое, селезенка).

После инкубации в течение 2 ч в термостате при 37^oС, 4 ч при комнатной температуре и ночи в холодильнике, центрифугируют при 4000-6000 об/мин в течение 10-15 мин, надосадок убирают, затем иммуносорбент тщательно отмывают в (ЗФР) с рН 7,20,2 для удаления несвязавшихся компонентов до тех пор, пока в промывных водах перестанет обнаруживаться белок. Затем с целью элюирования антигена к иммуносорбенту прибавляют 10-кратный объем диссоциирующего раствора, содержащего 3М роданистого калия подкисленного НСl с рН 5,0-5,5, центрифугируют тем же способом и проводят диализ надосадка от роданистого калия. Контроль за наличием ионов роданистого калия проводят с помощью качественной реакции с 1% FеСl₃.

В полученных таким образом антигенных фракциях из органов человека и животных, имеющих сродство к антигенам бруцеллезного микробов, измеряли содержание белка. Оно составляло от 0,1 до 0,2 мг/мл (измерения проводили спектрофотометрически при длине волны 280 нм). Наличие общих антигенных детерминант изучали в серологических реакциях (иммуноферментный анализ (ИФА), реакция прямой гемагглютинации (РПГА)). В РПГА антигены выявлялись в концентрации от 1,210^-2 до 510^-2 мг/мл, а в ИФА – 610^-3 мг/мл.

Формула изобретения

Способ выделения фракции гетерогенных антигенов, включающий формирование иммунного комплекса антиген-антитело путем контакта антигена и иммуносорбента, фиксацию на твердофазном носителе, отмывку иммуносорбента от несвязавшихся антигенов и диссоциацию фракции гетерогенных антигенов элюирующим раствором, отличающийся тем, что проводят выделение фракции гетерогенных антигенов, сходных между таковыми микроорганизмов рода Brucella и паренхиматозными тканями человека, в качестве антигенов используют водно-солевой экстракт из паренхиматозных тканей человека, контакт антигенов и иммуносорбента осуществляют смешиванием суспензии иммуносорбента с антигенами при соотношении 1:2-1:3 с последующей инкубацией смеси при 37^oС в течение 2-2,5 ч, при комнатной температуре 4-4,5 ч, при ^oС – 6-6,5 ч, а элюирующий раствор подкисляют до рН 5,0-5,5, при этом отделение и диссоциацию гетерогенных антигенов проводят путем центрифугирования или фильтрации через бумажный фильтр.

MM4A Досрочное прекращение действия патента Российской Федерации на изобретение из-за неуплаты в установленный срок пошлины за поддержание патента в силе

Дата прекращения действия патента: 31.07.2003

Извещение опубликовано: 20.02.2005 БИ: 05/2005