Патент на изобретение №2215293

(54) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ИММУНОГЕННОЙ АКТИВНОСТИ АНТИГЕНА ВИРУСА СИНДРОМА СНИЖЕНИЯ ЯЙЦЕНОСКОСТИ – 76 В АССОЦИИРОВАННОЙ ЭМУЛЬСИОННОЙ ИНАКТИВИРОВАННОЙ ВАКЦИНЕ

(57) Реферат:

Изобретение относится к области вирусологии. В исследуемом образце ассоциированной вакцины, содержащей два гемагглютинирующих антигена вирус ССЯ-76 и вирус ньюкаслской болезни (НБ), уровень гемагглютинина вируса ССЯ-76 в реакции гемагглютинации устанавливают после добавления в исследуемый образец вакцины равного количества специфической сыворотки к вирусу НБ и его выдергивания при 37^oС в течение 60 мин. Использование прямого способа детекции антигена вируса ССЯ-76 из ассоциированных эмульсионных инактивированных вакцин позволяет максимально быстро и объективно оценивать иммуногенность препаратов по данному компоненту и снизить материальные затраты на проведение исследований.

Предлагаемое изобретение относится к области ветеринарной вирусологии, в частности к способу определения иммуногенной активности антигена вируса синдрома снижения яйценоскости-76 (ССЯ-76) в ассоциированных эмульсионных инактивированных вирусвакцинах.

Для проверки иммуногенной активности вирусных вакцин с масляным адъювантом, содержащих антиген ССЯ-76, в настоящее время используют способ, включающий иммунизацию птицы биопрепаратом с последующим определением титра антител в сыворотках крови в РТГА или ИФА (1).

Недостатком данного способа является, во-первых, то, что создание напряженного и продолжительного иммунитета при вакцинации зависит от иммунного статуса птицы, количества и качества антигена в препарате, а также от адъювантов, иммуностимулирующее действие которых зависит от вида, дозы, срока и способа введения, а во-вторых, его длительность, большие затраты труда и средств.

Известен способ определения иммуногенной активности вирусных вакцин против ящура сельскохозяйственных животных, включающий извлечение специфического антигена из сложной смеси путем встряхивания в присутствии хлороформа, последующее отделение его от адъюванта центрифугированием и установлением его активности в реакции связывания комплемента (РСК) (2).

Использование данного способа для определения иммуногенной активности антигена вируса ССЯ-76 в инактивированной эмульсионной вакцине является возможным, но не позволяет получить достоверные результаты из-за неполного выделения антигена и невозможности использования серологической реакции РСК, как недостаточно разработанной для данной инфекции. Кроме этого, этот способ также требует больших затрат и средств.

Также известен способ определения иммуногенной активности антигена вируса ССЯ-76 в эмульсионной инактивированной вакцине, включающий освобождение гемагглютинина вируса ССЯ-76 от масляного адъюванта путем шуттелирования в присутствии хлороформа, последующее его отделение от адъюванта центрифугированием и установление его иммуногенной активности расчетным путем после определения в исследуемом образце вакцины уровня гемагглютинина вируса ССЯ-76 в реакции гемагглютинации (3).

Данный способ не позволяет получить достоверные данные по определению иммуногенной активности антигена вируса ССЯ-76 в исследуемом образце ассоциированной вакцины из-за входящего в ее состав компонента антигена вируса ньюкаслской болезни (НБ), который проявляет в РГА аналогично, как и антиген вируса ССЯ-76, гемагглютинирующую активность.

Целью изобретения является разработка способа, позволяющего достоверно определить иммуногенную активность антигена вируса ССЯ-76 в ассоциированной эмульсионной инактивированной вакцине.

Цель достигается тем, что в исследуемом образце ассоциированной вакцины, содержащей антиген вируса ССЯ-76 и антиген вируса НБ, уровень гемагглютинина вируса синдрома снижения яйценоскости-76 устанавливают после добавления в исследуемый образец вакцины равного количества специфической сыворотки к вирусу НБ и его выдерживания при температуре 37^oС в течение 60 минут.

Изобретение иллюстрируется следующими примерами.

Пример 1.

В колбы объемом 250 см³ вносят в соотношении 1:1 эмульсионную бивалентную вакцину против синдрома снижения яйценоскости-76 и ньюкаслской болезни и хлороформ. Смесь встряхивают на шуттельаппарате в течение 10 минут с частотой 4 колебания в секунду. Перемешанную таким образом смесь переносят в центрифужные пробирки и центирифугируют в течение 30 минут при 3500 об/мин. Верхнюю фракцию расслоившейся смеси, содержащую гемагглютинины вирусов ССЯ-76 и НБ, декантируют и нейтрализуют гипериммунной сывороткой к штамму “ЛА-СОТА” вируса НБ. Компоненты смешивают в соотношении 1:1 и выдерживают в термостате при температуре 37^oС в течение 60 мин.

Титр выделенного гемагглютинина вируса ССЯ-76 определяют титрованием в РГА с 0,7-1,0% суспензией эритроцитов петуха. За титр выделенного гемагглютинина вируса ССЯ-76 принимают самое высокое разведение вируса, вызывающего полную агглютинацию эритроцитов.

В данном случае гемагглютинирующий титр исследуемого образца в бивалентной вакцине составил 6,0 log₂.

Расчет исходного титра гемагглютинина, содержащегося в препарате, производят по формуле

где Х – титр гемагглютинина вируса ССЯ-76 в исходной вакцине;
Y – титр гемагглютинина вируса ССЯ-76, выделенного из вакцины.

Значения 14,509 и 1,8543 – поправочные коэффициенты, рассчитанные методом наименьших квадратов в “EXCEL”.

Рассчитанный титр гемагглютинина вируса ССЯ-76 в данном случае составляет 11,0 log₂, что говорит об иммуногенной активности данного антигена в бивалентной вакцине и пригодности ее для использования.

Пример 2.

Бивалентную эмульсионную вакцину против синдрома снижения яйценоскости-76 и ньюкаслской болезни смешивают в соотношении 1:1 с хлороформом, а затем центрифугируют для отделения специфических антигенов от масляного адъюванта аналогично, как в примере 1. Выделенную верхнюю фракцию, содержащую антигены вирусов ССЯ-76 и ЦБ, нейтрализуют гипериммунной сывороткой НБ из штамма “ЛА-СОТА” аналогичным способом и титруют в РГА с 0,7-1,0% суспензией эритроцитов петуха. Гемагглютинирующий титр вируса ССЯ-76 исследуемого образца в бивалентной вакцине составил 7,0 log₂.

Расчет исходного количества гемагглютинина вируса ССЯ-76 проводят аналогично, как в примере 1, его количество составляет 11,6 log₂, что соответствует его содержанию в препарате для создания напряженного иммунитета.

Для подтверждения достоверности полученных результатов данной вакциной иммунизируют 30 цыплят 110-суточного возраста, свободных от антител к вирусу ССЯ-76, в/м, в дозе 0,5 мл³. На 28-е сутки опыта от всех цыплят проводят отбор сывороток крови для определения среднегеометрического поствакцинального титра антител, и одновременно птицу заражают внутримышечно вирулентным штаммом “В8/78” вируса ССЯ-76 в дозе 3,0 lg ЭИД50/гол. После заражения на 14 и 21 сутки проводят отбор сывороток крови и в этот же период времени проводят вынужденный убой птицы по 10 голов для проведения патологоморфологических исследований репродуктивных органов (яичников и яйцеводов).

Среднегеометрический титр антител на 28-е сутки после вакцинации составил 8,0 log₂. В результате проведенных гистологических исследований репродуктивных органов после контрольного заражения патолого-морфологические изменения в репродуктивных органах отсутствовали. Уровень сероконверсии на 21-е сутки после заражения составил 1,4.

Приведенные данные говорят о том, что данная вакцина иммуногенна и пригодна к использованию. Причем предложенный способ позволяет сделать заключение о ее качестве намного быстрее и с меньшими затратами.

Пример 3
Определяют иммунногенную активность антигена вируса ССЯ-76 в архивном исследуемом образце бивалентной вакцины против синдрома снижения яйценоскости-76 и ньюкаслской болезни аналогично, как и примере 1.

Гемагглютинирующая активность выделенного антигена вируса ССЯ-76 исследуемого образца вакцины в РГА составила 1,2 log₂, расчетный титр соответственно 8,5 log₂.

Для подтверждения достоверности полученных результатов данной вакцины проводят ее исследования на 30 цыплятах 110 дневного возраста, как в примере 2.

Результаты проведенных исследований показывают, что среднегеометрический титр антител через 28 суток после вакцинации составил 5,8 log₂. Контрольное заражение подтвердило низкую иммуногенность данной вакцины, уровень сероконверсии на 21-е сутки после заражения вирулентным вирусом составил 30,4. Результаты гистологического исследования репродуктивных органов убитых птиц выявили характерные для инфекции ССЯ-76 патолого-морфологические изменения. В яичниках отмечают меньшее число фолликулов различной стадии зрелости с частичной дегенерацией эпителия и незначительные кровоизлияния около дегенерирующих фолликулов по сравнению с интактной птицей. Одновременно регистрируют интенсивную гипоплазию яичников.

В белковом отделе яйцевода обнаруживают лимфоидно-гистоцитарные пролифераты, вызывающие атрофию железистой ткани, в маточном отделе гиперемию и отек слизистой оболочки. Складки слизистой оболочки яйцевода также содержат значительно меньшее количество железистой ткани, а стенки его в различных отделах были намного тоньше, чем в аналогичных структурах у интактных птиц.

Таким образом, данная серия вакцины обладает низкой иммуногенной активностью и непригодна для использования.

Пример 4.

Определяют иммуногенную активность вируса ССЯ-76 в исследуемом образце трехвалентной вакцины против синдрома снижения яйценоскости-76, ньюкаслской болезни и инфекционного ларинготрахеита птиц аналогично, как в примере 1.

Гемагглютинирующая активность выделенного антигена вируса ССЯ-76 в РГА составила 7,0 log₂, расчетный титр соответственно 11,5 log₂.

Таким образом, данная вакцина в отношении антигена вируса ССЯ-76 высокоиммуногенна и пригодна для использования.

Пример 5
Иммуногенную активность архивной серии ассоциированной вакцины против синдрома снижения яйценоскости-76, ньюкаслской болезни и инфекционного бронхита кур, хранившуюся в течение 2 лет, проверяют аналогично, как в примере 1. Результаты исследования показывают отсутствие в выделенной фракции гемагглютинирующего антигена вируса ССЯ-76, так как титр гемагглютинина вируса ССЯ-76 в выделенной фракции был <1, что говорит о невозможности использования данного препарата.

Использование прямого способа детекции антигена вируса ССЯ-76 из ассоциированных эмульсионных инактивированных вирусвакцин позволит максимально объективно оценивать иммуногенность препаратов по данному компоненту, значительно сократить сроки определения их пригодности, а также снизить материальные затраты на проведение исследований.

Источники информации

2. RU 2082983 C1, 27.06.97.

3. Кочеткова Е.С.; Смоленский В.И.; Парфенова И.Л. и Рождественский И.К. “Разработка метода освобождения гемагглютинина из эмульгированных моновалентных вакцин против синдрома снижения яйценоскости-76”, в сб. научных трудов ВГНКИ, М., 2000, т.63, стр.107-114.

Формула изобретения

Способ определении иммуногенной активности антигена вируса синдрома снижения яйценоскости-76 в ассоциированной эмульсионной инактивированной вакцине, содержащей антиген вируса синдрома снижения яйценоскости-76 и антиген вируса ньюкаслской болезни, заключающийся в отборе пробы вакцины, освобождении гемагглютининов вируса синдрома снижения яйценоскости-76 и вируса ньюкаслской болезни от масляного адъюванта путем шуттелирования в присутствии хлороформа с последующим центрифугированием, затем верхнюю фракцию, содержащую гемагглютинины указанных вирусов, декантируют, смешивают в равном соотношении со специфической гипериммунной сывороткой против ньюкаслской болезни, выдерживают смесь при 37^oС в течение 60 мин, после чего определяют гемагглютинирующий титр вируса синдрома снижения яйценоскости-76 в реакции гемагглютинации, по которому расчетным путем устанавливают иммуногенную активность данного антигена.

MM4A Досрочное прекращение действия патента из-за неуплаты в установленный срок пошлины за
поддержание патента в силе

Дата прекращения действия патента: 22.12.2010

Дата публикации: 10.12.2011