Патент на изобретение №2213138

(54) ШТАММ МИКРОСКОПИЧЕСКОГО ГРИБА TRICHODERMA VIRIDE BOCG 63/300 – ПРОДУЦЕНТ ЦЕЛЛЮЛАЗ И ГЕМИЦЕЛЛЮЛАЗ

(57) Реферат:

Изобретение относится к биотехнологии, касается производства ферментов и представляет собой новый штамм Trichoderma viride BOCG 63/300 – продуцент целлюлаз и гемицеллюлаз. Штамм Т. viride BOCG 63/300 получен в результате ступенчатой мутагенной обработки штамма Т. viride 44-11-62/3. При определенных условиях ферментации продуцирует оригинальный комплекс целлюлаз и гемицеллюлаз, обеспечивающих его высокую продуктивность при использовании в различных отраслях народного хозяйства с целью гидролиза некрахмальных полисахаридов растительного сырья.

Изобретение относится к биотехнологии, используется в микробиологической промышленности для производства ферментов и представляет собой новый штамм Trichoderma viride BOCG 63/300 – продуцент внеклеточных целлюлаз и гемицеллюлаз.

Ферментный препарат, получаемый на основе штамма, может быть использован в сельскохозяйственном производстве, пищевой, текстильной, целлюлозно-бумажной промышленности с целью гидролиза некрахмальных полисахаридов растительного сырья. В его состав входят высокоактивные ферменты цитолитического комплекса целлюлазы и гемицеллюлазы (-глюканазы, ксиланазы), катализирующие гидролиз целлюлозы и гемицеллюлозы до низкомолекулярных углеводов – глюкозы, целлобиозы, маннозы, галактозы, арабинозы, ксилозы.

Штамм Trichoderma viride ВОCG 63/300 получен в результате ступенчатой мутагенной обработки конидий исходного штамма Trichoderma viride 44-11/62/3 (F-374).

Отличительной особенностью нового штамма является то, что он при определенных условиях культивирования синтезирует оригинальный комплекс ферментов эндо-1,4--глюканаз, экзо-1,4--глюканаз, целлобиаз, ксиланаз, обеспечивающих высокую эффективность ферментного препарата, получаемого на его основе, при использовании в различных отраслях народного хозяйства.

Предлагаемый штамм Trichoderma viride BOCG 63/300 отличается от известных продуцентов высоким уровнем биосинтеза целлюлаз и гемицеллюлаз. Штамм быстрорастущий в глубинных условиях на питательной среде, содержащей пшеничные отруби и бумажную пыль; на 96 часу роста достигается активность целлюлазы по фильтровальной бумаге (АФБ) 100-105 ед/мл, активность -глюканазы – 110 ед/мл, активность ксиланазы – 450-500 ед/мл.

Известны продуценты целлюлаз Trichoderma viride 44 (Авт. свид. 745933, 1978 г. ), Trichoderma viride 13/10 (авт. св. 923188, 1984 г.), которые используются в производстве целлюлаз при культивировании на питательных средах, содержащих свекловичный жом и минеральные соли.

Однако эти штаммы характеризуются относительно низким уровнем биосинтеза целлюлаз и ксиланаз, а также отсутствием биосинтеза глюканаз при культивировании в глубинных условиях.

В патенте 2018534, 1994 г. описан способ получения комплекса целлюлозолитических ферментов, предназначенных для обработки растительного сырья, предусматривающий совместное глубинное выращивание штаммов-продуцентов Trichoderma viride 44 и Aspergillus foetidus M-45.

В патенте РФ 2001949 описан штамм Trichoderma reesi ВСМ 18.2/КК – продуцент целлюлаз, пригодный для культивирования в присутствии высоких концентраций сахаров, в том числе на молочной сыворотке. Уровень активности целлюлазы этого штамма достигает 3,5-4,2 ед/мл через 110 часов культивирования на среде следующего состава:
40 г/л – свекловичный жом;
14 г/л – солодовые ростки;
6 г/л – аммоний сернокислый;
2 г/л – калий фосфорнокислый однозамещенный;
0,6 г/л – магний сернокислый;
вода водопроводная;
pH 5,4.

На питательной среде, включающей 20,0 г молочного сахара, 4,0 г микрокристаллической целлюлозы и минеральные соли, уровень активности целлюлазы при культивировании вышеназванного штамма в ферментере объемом 200 л составил 18,2 ед/мл в условиях дробного добавления лактозы.

Наиболее близким аналогом к заявленному штамму является Trichoderma viride 44-11-62/3 (Патент 1525208, 1989 г.) – продуцент целлюлазы и ксиланазы, синтезирующий ферменты на питательной среде, содержащей:
3,0 г/л – свекловичный жом;
1,43 г/л – солодовые отростки;
0,4 г/л – аммоний сернокислый;
0,2 г/л – калий фосфорнокислый однозамещенный;
0,4 г/л – натрий азотнокислый;
0,03 г/л – магний сернокислый;
5,0 г/л – картофельная бapда;
вода водопроводная;
pH 5,4.

Продолжительность культивирования этого продуцента на круговой качалке составляет 168 ч. Активность целлюлазы в этих условиях составляет 24 ед/мл, ксиланазы – 21 ед/мл культуральной жидкости.

Существенным недостатком штамма является низкий уровень ферментов и сравнительно большая продолжительность культивирования.

Целью изобретения является получение высокоактивного штамма – продуцента целлюлаз и гемицеллюлаз Trichoderma viride BOCG 63/300, обладающего высокой биосинтезирующей активностью при культивировании его на ферментационных средах с целлюлозой и пшеничными отрубями.

Штамм Trichoderma viride ВОCG63/300 получен в результате ступенчатой мутагенной обработки исходного штамма Trichoderma viride 44-11-62/3 с использованием УФ-лучей и этиленимина с последующим отбором моноколоний по признаку ферментообразования.

Для определения активности ферментов культуральную жидкость центрифугировали при 3000 об/мин в течение 20 мин и использовали супернатант.

Активность целлюлазы характеризовали по гидролизу фильтровальной бумаги с определением образующихся сахаров по методу Шомоди-Нельсона.

За единицу целлюлолитической активности принята способность ферментов образовывать 1 мг восстанавливающих сахаров (в пересчете на глюкозу) при действии на целлюлозу фильтровальной (хроматографической) бумаги при температуре 50^oС и рН 4,7 в течение часа.

Метод определения экзо--глюканазной активности основан на определении восстанавливающих сахаров, образующихся при действии фермента на 1,3/1,4 -глюкан.

За единицу экзо--глюканазной активности принято такое количество фермента, которое в стандартных условиях (температура 50^oС, рН 5,0) гидролизует -глюкан со скоростью, соответствующей образованию восстанавливающих групп, эквивалентных 1 микромолю глюкозы в минуту.

Метод определения ксиланазной активности основан на определении восстанавливающих сахаров, образующихся при действии фермента ксиланазы на ксилан.

За единицу ксиланазной активности (КсА) принимают такое количество фермента, которое в стандартных условиях (температура 50^oС, рН 5,0) гидролизует ксилан со скоростью, соответствующей образованию восстанавливающих групп, эквивалентных 1 микромолю глюкозы в минуту.

Культурально-морфологические признаки
Культура хорошо развивается на 6%-ном сусло-агаре, на картофельно-декстрозном агаре, на модифицированном агаре Чапека-Докса с добавлением кукурузного экстракта, на агаре Роулен-Тома.

На сусло-агаре на пятые сутки роста при температуре 30^oС – колонии белые, плоские, округлые (диаметр колоний 5,0-5,5 см) с неровными краями.

Мицелий бесцветный, ползучий, быстро растущий. Дернинки с конидиеносцами, желтовато-оливкового цвета. Конидиеносцы разветвленные с мутовчатыми ответвлениями. Конидии овальные, размером (2,8-3,5)-(5,0-9,5) мкм, в массе желтовато-зеленые. В среду выделяется желтый пигмент.

На картофельно-декстрозном агаре наблюдается быстрый рост колоний, на пятые сутки роста диаметр колоний достигает 7-8 см. Колонии концентрические, подложка белая, конидии окрашены в желто-зеленый цвет. Среда пигментированная, желтая.

На среде Чапека-Докса с добавлением кукурузного экстракта на пятые сутки роста в термостате при 30^oС диаметр колоний 3,0-3,5 см, колонии округлые, светлые, складчатость отсутствует, спороношение слабое, конидии оливковые в центральной части колонии.

На среде Роулен-Тома колонии быстрорастущие, концентрические, выпуклые, пушистые, края волнистые, мицелий белый. Спороношение обильное по всей колонии. Конидии желто-зеленого цвета. В среду выделяется желтый пигмент.

При культивировании штамма Trichoderma viride BOCG 63/300 в глубинных условиях на ферментационной питательной среде к 12 часам роста конидии прорастают, начинают ветвиться и образуют боковые побеги. К 24 часам роста разрастаются многочисленные колонии с гомогенной базофильной цитоплазмой. После 36-48 часов роста протоплазма гиф претерпевает изменения. Гифы интенсивно растут в длину, утончаются и образуют густое сплетение мицелия. Протоплазма гомогенна, базофилия ее длительно сохраняется. Весь дальнейший рост мицелия сопровождается увеличением массы гиф. К 60-72 часам роста базофилия протоплазмы снижается, отдельные гифы переходят в состояние автолиза, общая способность гиф окрашиваться метиленовым синим резко снижается.

Активность целлюлазы, ксиланазы и -глюканазы в этот период значительно возрастает и достигает максимума к 96-110 часам.

Физиолого-биохимические признаки
Штамм хорошо усваивает глюкозу, фруктозу, сахарозу, мальтозу, крахмал, маннит. Желатину разжижает, молоко не коагулирует.

Усваивает аммонийную и нитратную форму азота. Усваивает разнообразные фосфорные соединения, более предпочтителен однозамещенный фосфорнокислый калий.

Культура – строгий аэроб. Оптимальная температура для роста и биосинтеза целлюлаз и гемицеллюлаз (302)^oC. Оптимaльный рН питательных сред для роста и биосинтеза ферментов 5,0-5,5.

Примеры использования штамма Trichoderma viride BOCG 63/300
Пример 1. Штамм Trichoderma viride BOCG 63/300 выращивают в пробирках на скошенном сусло-агаре в течение 5 суток при температуре 30^oС и 10 суток выдерживают при комнатной температуре. Суспензией спор инокулируют питательную среду следующего состава, %:
– жом свекловичный – 3,0;
– аммоний сернокислый – 0,7;
– солодовые ростки – 1,4;
– дрожжи кормовые – 0,15;
– калий фосфорнокислый однозамещенный – 0,2;
– магний сернокислый – 0,03;
– вода водопроводная – до 100;
– рН до стерилизации – 5,0.

Культивирование осуществляют в качалочных колбах на 50 мл питательной среды в течение 120-130 часов на круговой качалке при 220 об/мин и температуре 29^oС. Активность целлюлазы – 63 ед/мл культуральной жидкости, ксиланазы – 300 ед/мл, -глюканазы – 100 ед/мл.

Пример 2. Для получения инокулята используется питательная среда следующего состава, %:
– аммоний сернокислый – 0,4;
– отруби пшеничные – 1,0;
– калий фосфорнокислый однозамещенный – 0,2;
– лактоза – 0,5;
– вода водопроводная – до 100;
– pН 5,0.

Засев посевной среды осуществляют суспензией спор культуры, выращенной на сусло-агаре. Инокулят выращивают в качалочных колбах емкостью 0,75 л при температуре 30^oС в течение 18-24 часов. Полученным инокулятом засевают ферментационную среду следующего состава, %:
– отруби пшеничные – 2,0;
– целлюлоза – 0,7;
– кукурузный экстракт – 1,0;
– дрожжи кормовые – 0,5;
– аммоний сернокислый – 0,8;
– калий фосфорнокислый однозамещенный – 0,2;
– вода водопроводная – до 100;
– pН 5,0;
– объем питательной среды в колбе – 50 мл.

– количество инокулята – 5 мл.

Ферментацию штамма Trichoderma viride BOCG 63/300 проводят в колбах емкостью 0,75 мл на круговой качалке при 210 об/мин и температуре 29^oС. Продолжительность процесса 100-110 часов. Активность целлюлазы 60-65 ед/мл, ксиланазы 300-350 ед/мл, -глюканазы 80 ед/мл.

Пример 3. Культивирование осуществляют на той же питательной среде, что и в примере 2, но целлюлозу вводят в питательную среду на вторые сутки в качестве подпитки для индукции биосинтеза целлюлазы.

Процесс ферментации проводят в ферментере емкостью 0,5 м³ с коэффициентом заполнения 0,5 при температуре 302^oС, расход воздуха поддерживают на уровне 0,8 м³/м³ среды в минуту, перемешивание непрерывное при работе мешалки 180 об/мин.

Стерильный раствор целлюлозы добавляют на 22-26 часы роста культуры.

Используемая среда обладает улучшенными реологическими свойствами по сравнению с питательными средами, содержащими свекловичный жом, что позволяет интенсифицировать процессы роста продуцента за счет улучшения массообменных процессов.

Уровень активности целлюлазы на 110 ч ферментации составляет 100-105 ед/мл, ксиланазы – 450-500 ед/мл, -глюканазы – 100-110 ед/мл.

Предлагаемый штамм Trichoderma viride BOCG 63/300 имеет следующие преимущества по сравнению с прототипом:
– более высокую целлюлазную активность;
– наличие в ферментном комплексе ксиланазы и -глюканазы;
– низкую продолжительность роста культуры.

Указанные преимущества дадут возможность использовать заявленный штамм в производстве ферментных препаратов целлюлазного и гемицеллюлазного действия.

Формула изобретения

Штамм гриба Trichoderma viride BOCG 63/300 – продуцент целлюлаз и гемицеллюлаз.

MM4A – Досрочное прекращение действия патента СССР или патента Российской Федерации на изобретение из-за неуплаты в установленный срок пошлины за поддержание патента в силе

Дата прекращения действия патента: 06.11.2007

Извещение опубликовано: 27.06.2009 БИ: 18/2009