Патент на изобретение №2149184

(54) ШТАММ БАКТЕРИЙ BRUCELLA ABORTUS, ИСПОЛЬЗУЕМЫЙ ДЛЯ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ИММУНОГЕННОЙ АКТИВНОСТИ ВАКЦИН ПРОТИВ БРУЦЕЛЛЕЗА СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННЫХ ЖИВОТНЫХ

(57) Реферат:

Изобретение предназначено для контроля биопрепаратов против бруццеллеза сельскохозяйственных животных. Новый штамм Brucella abortus способен стабильно репродуцироваться на питательных средах, содержащих ингибитор роста бруцелл вакцинных штаммов и посторонней микрофлоры. В качестве ингибитора роста используют бис-трифенилангидрокарбинол оксалат в концентрации 0,001%. Штамм непатогенен для животных и человека. Штамм Brucella abortus депонирован в коллекции микроорганизмов Всероссийского государственного научно-исследовательского института контроля стандартизации и сертификации ветеринарных препаратов (ВГНКИ) и имеет регистрационный номер КВ 13/100-ДЕП. Иммуногенную активность противобруцеллезных вакцин определяют по скорости элиминации из организма имммунизированных животных бруцелл контрольного штамма B. abortus ВГНКИ КВ 13/100-ДЕП. Иммунизируют лабораторных животных (мышей, морских свинок) противобруцеллезной вакциной. Затем иммунизированным животным вводят культуру контрольного штамма B. abortus ВГНКИ КВ 13/100. Животных забивают. Проводят бактериологические исследования лимфатических узлов и внутренних органов. Для этого высевают патматериал на питательные среды с бис-трифенилангидрокарбинол оксалатом в концентрации 0,01%. Иммунными считают животных, из организма которых полностью элиминировались бруцеллы контрольного штамма за определенный период времени. Использование контрольного вакцинного штамма Brucella abortus ВГНКИ КВ 13/100 позволяет обезопасить контроль эффективности биопрепаратов, увеличить количество проверяемых серий, значительно повысить качество вакцин и за счет этого существенно повысить эффективность специфической профилактики бруцеллеза. 4 табл.

Изобретение относится к области ветеринарной микробиологии и представляет собой новый штамм бактерий Brucella abortus, используемый для определения иммуногенной активности вакцин против бруцеллеза сельскохозяйственных животных.

Эффективность специфической профилактики бруцеллеза животных и человека зависит от качества применяемых для профилактики заболевания противобруцеллезных вакцин и, в первую очередь, их специфической эффективности. Показателем специфической эффективности противобруцеллезных вакцин является иммуногенная активность или иммуногенность препаратов, определяемая в тесте активной защиты иммунизированных лабораторных животных (морские свинки, линейные мыши) от заражения культурами бруцелл вирулентных штаммов. Иммунными считают тех животных, у которых при бактериологическом исследовании лимфатических узлов и органов не выделяются бруцеллы вирулентного штамма, либо их выделяют значительно меньше, чем у зараженных невакцинированных (контрольных) животных.

Известен штамм Brucella abortus 54М/ВГНКИ, используемый для определения иммуногенной активности вакцин против бруцеллеза сельскохозяйственных животных.

Для штамма характерны основные свойства, присущие штаммам бруцелл, но он обладает отличительной особенностью – высокой вирулентностью для животных и человека (1).

Однако штамм Brucella abortus 54 М/ВГНКИ имеет ряд существенных недостатков.

Во-первых, он является опасным для людей и животных. В связи с этим, проверка иммуногенной активности каждой серии препаратов с использованием данного штамма заменена выборочным контролем только 2-3 серий вакцин в условиях специализированных учреждений, имеющих разрешение на работу с микроорганизмами второй группы, что не всегда обеспечивает высокую достоверность получаемых результатов и объективную оценку эффективности препаратов.

Во-вторых, иммуногенность живых противобруцеллезных вакцин проверяют до наступления стерильного иммунитета, то есть в отдельных органах и тканях иммунизированных животных к моменту заражения культурой вирулентного штамма циркулируют бруцеллы аттенуированного вакцинного штамма. В связи с этим, на последнем этапе определения иммуногенности (бактериологическом исследовании) в обязательном порядке проводят дифференциацию бруцелл вирулентной культуры от вакцинного штамма, что требует больших затрат времени и небезопасно для человека. Кроме того, не представляется возможным определение уровня инфицированности органов заразившихся животных (количества бруцелл вирулентного штамма на 1 г или 1 мг органа).

Целью настоящего изобретения является получение нового штамма бруцелл, предназначенного для определения иммуногенной активности вакцин против бруцеллеза сельскохозяйственных животных, непатогенного для человека и животных, способного стабильно репродуцироваться на питательных средах, содержащих ингибитор роста бруцелл для вакцинных штаммов и посторонней микрофлоры.

Штамм Brucella abortus получен в результате целенаправленной селекции по культуральным, морфологическим, биохимическим, агглютинабельным, антигенным и иммуногенным свойствам из вакцинного штамма Brucella abortus 104М.

Штамм Brucella abortus депонирован в коллекции микроорганизмов Всероссийского государственного научно-исследовательского института контроля стандартизации и сертификации ветеринарных препаратов (ВГНКИ) и имеет регистрационный номер KB 13/100 ДЕП.

Штамм Brucella abortus ВГНКИ N KB 13/100 характеризуется следующими признаками и свойствами.

Морфологические признаки.

Бруцеллы штамма – короткие грамотрицательные палочки с закругленными концами, расположенные изолированно, попарно реже в виде коротких цепочек, без спор и капсулы. Размер 1,0-1,2 мкм, шириной 0,5-0,6 мкм.

Культуральные свойства.

Культура штамма хорошо растет в аэробных условиях на плотных и жидких питательных средах: мясо-пептонном печеночном глюкозо-глицериновом агаре (МППГГА), печеночно-мартеновском агаре (ПМА), печеночно-мартеновском arape с переваром Хоттингера (ПМАХ), картофельном агаре с переваром Хоттингера (КАХ), мясо-пептонном печеночном глюкозо-глицериновом бульоне (МППГГБ), печеночном глюкозо-глицериновом бульоне (ПГГБ), а также на этих и других средах, предназначенных для культивирования бруцелл с добавлением 0,001% бис-трифенилангидрокарбинола оксалата.

На МППГГА, МПХА и других плотных питательных средах, предназначенных для культивирования бруцелл (4-5 сутки инкубирования при (37-38^oC) растет в виде круглых, выпуклых, гладких, с четко контурированным краем, прозрачных колоний с диаметром 2,0-2,5 мм. При окрашивании раствором кристаллического фиолетового 1/2000 (по Уайт-Вилсону) 100% колоний окрашивается как S-форма: светло-желтый центр и темно-фиолетовый тонкий ободок. При культивировании на плотных средах, содержащих бис-трифенилангидрокарбинола оксалат колонии зеленого цвета.

На МППГГБ и других жидких питательных средах, предназначенных для культивирования бруцелл на 4-5 сутки инкубирования при 37-38^oC, рост бактерий характеризуется легкой опалесценцией среды и тонким пристеночным кольцом голубоватого цвета.

Биохимические свойства.

Культура штамма растет на дифференциальных питательных средах (на основе МППГГА и других плотных питательных сред), содержащих: фуксин в концентрации 1 : 50000; бис-трифенилангидрокарбинола оксалат в концентрации 1:100000 (маркер); 5 мкг/см³ стрептомицина сульфат и не растет на средах, содержащих: тионин в концентрации 1 : 50000; пенициллин 5 ЕД/см³; эритритол 1 мг/см³.

Не продуцирует H₂S.

Лизируется фагом Тб.

Агглютинабельные свойства.

Культура штамма агглютинируется S-антибруцеллезной сывороткой и не агглютинируется R-антибруцеллезной сывороткой. Штамм обладает типоспецифической агглютинабельностью: агглютинируется А монорецепторной сывороткой до ее титра и не агглютинируется М сывороткой в разведении 1:10.

Антигенные свойства.

При введении морским свинкам в дозе 110⁹ микробных клеток и кроликам в дозе 710⁹ микробных клеток у животных вырабатываются только S-антитела: агглютинины от 100 до 1000 МЕ/см³ и комплементсвязывающие антитела в титрах от 1:20 до 1:160.

Сыворотка крови животных в разведении 1:10 не дает положительной реакции с R-бруцеллезными антигенами.

Патогенность.

Штамм Brucella abortus ВГНКИ N KB 13/100 безвреден. При введении мышам 250 млн. микробных клеток и морским свинкам 2 млрд. микробных клеток не вызывает патологоанатомических изменений, характерных для бруцеллеза. Бруцеллы штамма не мигрируют от вакцинированных животных к интактным.

При совместном содержании в течение 90 дней интактных морских свинок с животными, которым вводят культуру штамма Brucella abortus ВГНКИ N KB 13/100 в дозе 2 млрд. микробных клеток, при последующем бактериологическом исследовании из лимфатических узлов и внутренних органов невакцинированных животных (10 объектов) бруцеллы штамма KB 13/100 не выделяются.

Вирулентность
При внутрибрюшинном введении культуры штамма мышам линии C₅₇Блек/6 и убое животных с последующим бактериологическим исследованием селезенки ИД₅₀ штамма KB 13/100 составляет 250-1000 микробных клеток (p=0,05).

Стабильность основных свойств штамма при пассировании.

Штамм стабилен в отношении основных свойств на протяжении 10 пассажей на плотных и жидких питательных средах и 5 пассажей на морских свинках (срок наблюдения).

Изобретение иллюстрируется следующими примерами.

Пример 1.

Определяют возможность использования контрольного штамма Brucella abortus ВГНКИ N KB 13/100 для контроля иммуногенной активности живой противобруцеллезной вакцины из штамма B. abortus 19 (эталонная серия N6, с заведомо известной высокой иммуногенностью для сельскохозяйственных животных, многократно проверенной в опыте на линейных мышах.

Мышей линии C₅₇Блек/6 самок 5-6-недельного возраста иммунизируют вакциной из штамма 19 в дозах 100, 1000, 10000 и 100000 микробных клеток. Вакцину вводят под кожу в объеме 0,2 см³. Через 15 дней после иммунизации животным вводят культуру штамма B. abortus ВГНКИ N KB 13/100 в дозах от 25, 125, 625, 3125, 15625, 78125 и 390625 микробных клеток (по шесть иммунизированных мышей на одну дозу). Одновременно культуру штамма вводят 24 невакцинированным мышам в дозах 25, 125, 625, 3125 микробных клеток.

Спустя 10-12 дней мышей убивают и проводят бактериологическое исследование селезенки. Селезенку растирают в гомогенизаторе и высевают на мясо-пептонный печеночный глюкозо-глицериновый агар, содержащий 0,001% бис-трифенил-ангидрокарбинола оксалата. Посевы инкубируют при 37-38^oC в течение 4-5 суток и учитывают наличие колоний бруцелл контрольного штамма. Результаты бактериологического исследования приведены в таблице 1.

Данные таблицы 1 говорят, что скорость элиминации бруцелл контрольного вакцинного штамма B. abortus ВГНКИ N KB 13/100 возрастает с увеличением дозы вакцины и уменьшается с увеличением его дозы, тем самым подтверждая возможность его использования для количественной оценки иммуногенной активности противобруцеллезных вакцин по показателям ИмД₅₀ (50%-ной иммунизирующей дозе) и индексу иммунитета (отношению 50%-ной инфицирующей дозы для иммунизированных мышей к таковой для контроля).

Исходя из представленных в таблице 1 результатов рассчитывают по Керберу ИмД₅₀ вакцины и индекс иммунитета.

Для группы мышей, которым вводят контрольный штамм B. abortus ВГНКИ N КВ13/100 в дозе 15625 микробных клеток ИмД₅₀ вакцины из штамма 19, равняется 10^2,50(316) микробных клеток. ИД₅₀ для мышей, иммунизированных в дозе 100 микробных клеток, равняется 10^4,09 микробных клеток, а для контрольных – 10^2,11. Индекс иммунитета 10^1,98.

Пример 2.

В опыте на мышах определяют иммуногенную активность вакцины из штамма B. abortus 19 по скорости элиминации бруцелл штамма B. abortus ВГНКИ N KB 13/100, рассчитывая показатель ИмД₅₀, как это отражено в Примере 1.

Мышей линии C₅₇Блек/6 самок 5-6-недельного возраста иммунизируют вакциной из штамма 19 (эталонная серия 6 с заведомо известной иммуногенностью: 90% для морских свинок и 70-80% для крупного рогатого скота) в дозах 100, 1000, 10000 и 100000 микробных клеток (по шесть мышей на каждую дозу). Вакцину вводят под кожу в объеме 0,2 см³. Через 15 дней после иммунизации животным вводят культуру контрольного штамма B. abortus KB 13/100 в дозе 15625 микробных клеток. Одновременно культуру контрольного штамма вводят 6 невакцинированным мышам. Далее как в Примере 1. Опыт повторяют пять раз. Результаты определения иммуногенной активности вакцины приведены в таблице 2.

По результатам проведенных исследований значения ИмД₅₀ для вакцины из штамма 19, определенные в разных опытах, достоверно (р=0,05) не различаются и находятся в пределах 10^1,73-10^3,18 микробных клеток. Полученные результаты подтверждают высокую воспроизводимость определения иммуногенной активности вакцин с использованием штамма Brucella abortus ВГНКИ N KB 13/100.

Пример 3.

Устанавливают чувствительность определения иммуногенной активности вакцин с использованием штамма Brucella abortus ВГНКИ N KB 13/100 и его корреляцию с известным способом определения иммуногенной активности противобруцеллезных вакцин по устойчивости к заражению культурой бруцелл известным штаммом B. abortus 54М/ВГНКИ.

Иммуногенную активность трех противобруцеллезных вакцин с заведомо разной иммуногенностью определяют аналогично, как в Примере 2 и в тесте активной защиты от заражения культурой вирулентного штамма B. abortus 54М/ВГНКИ на равном поголовье мышей. Рассчитывают по Керберу ИмД₅₀ для трех вакцин.

Результаты приведены в таблице 3.

В результате проведенных исследований установлена высокая чувствительность предлагаемого способа и высокая степень корреляции с известным способом.

Пример 4.

Определяют иммуногенную активность живой вакцины из штамма B. abortus 19 в опыте на морских свинках.

В опыт берут 15 морских свинок массой 350-400 г. Животных иммунизируют вакциной из штамма B. abortus 19 в дозе 110⁹ микробных клеток. Вакцину вводят в объеме 1 см³ под кожу в область паха. Через 90 дней всем иммунизированным и 15 контрольным (невакцинированным) животным вводят культуру контрольного штамма B. abortus ВГНКИ N KB 13/100 в дозе 1,510⁵ микробных клеток в объеме 1 см³ под кожу в область паха. Спустя 30-32 дня животных убивают и проводят бактериологическое исследование лимфатических узлов, печени, селезенки и костного мозга (всего 10 объектов). Патматериал высевают пипетками Пастера в пробирку с мясо-пептонным печеночным глюкозо-глицериновым бульоном, которым засевают две пробирки с МППГГА, содержащим бис-трифенилангидрокарбинол оксалат в концентрации 0,01%. Посевы инкубируют при 37-38^oC в течение 5-7 дней. Учитывают наличие культур бруцелл контрольного штамма. Иммунными считают животных, из органов и лимфатических узлов которых не выделена культура контрольного штамма. Показателем иммуногенности служит отношение количества освободившихся от бруцелл контрольного штамма морских свинок к количеству животных в группе, выраженное в процентах. В качестве дополнительного показателя используют индекс инфицированности – отношение количества лимфоузлов и внутренних органов, из которых выделена культура контрольного штамма, к общему количеству исследованных объектов, умноженное на 100.

В результате проведенных бактериологических исследований устанавливают, что вакцина из штамма B. abortus 19 защищает 86,7% иммунизированных животных. Индекс инфицированности составляет 3,33.

Пример 5.

Определяют иммуногенную активность противобруцеллезных вакцин по скорости элиминации бруцелл штамма B. abortus ВГНКИ N KB 13/100 и с заражением вакцинированных морских свинок культурой известного контрольного штамма B. abortus 54 М/ВГНКИ, в опыте на морских свинках.

Определяют иммуногенную активность живых вакцин из штаммов B. abortus 19 и 82 и экспериментальных адъювант-вакцин N1, N2, N3 из убитых бруцелл.

Морских свинок (по 26 – 30 голов в группе) иммунизируют вакцинами в принятых дозах. Спустя 90 дней после иммунизации половину животных из каждой группы заражают стандартной культурой известного контрольного штамма B. abortus 54М/ВГНКИ в дозе 100 микробных клеток (20 ИД₅₀) и оставшимся свинкам вводят культуру предложенного контрольного штамма B. abortus ВГНКИ N KB 13/100 в дозе 1,510⁵ микробных клеток. Культуры контрольных штаммов вводят под кожу в область паха в объеме 1 см³. Через 30-35 дней животных убивают и проводят бактериологическое исследование лимфатических узлов и внутренних органов (по Примеру 4). Патматериал от морских свинок, зараженных штаммом B. abortus 54М/ВГНКИ, высевают в пробирки с МППГГБ и МППГГА. Выделенные культуры дифференцируют по чувствительности к пенициллину.

Результаты исследований приведены в таблице 4.

В результате проведенных исследований установлена высокая чувствительность определения иммуногенности вакцин по скорости элиминации бруцелл штамма B. abortus ВГНКИ N KB 13/100 и корреляция получаемых результатов с таковыми при заражении подопытных животных культурой вирулентного штамма B. abortus 54М/ВГНКИ.

Таким образом, предлагаемый контрольный штамм B. abortus ВГНКИ N KB 13/100 позволяет обезопасить контроль эффективности препаратов, увеличить количество проверяемых серий, значительно повысить качество вакцин и за счет этого существенно повысить эффективность специфической профилактики бруцеллеза.

Формула изобретения

Штамм бактерий Brucella abortus ВГНКИ КВ 13/100, используемый для определения иммуногенной активности вакцин против бруцеллеза сельскохозяйственных животных.

РИСУНКИ