Патент на изобретение №2209830

(54) НАБОР ОЛИГОНУКЛЕОТИДОВ-ПРАЙМЕРОВ ДЛЯ ИДЕНТИФИКАЦИИ РНК ВИРУСА КРЫМСКОЙ-КОНГО ГЕМОРРАГИЧЕСКОЙ ЛИХОРАДКИ

(57) Реферат:

Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано в медицине для выявления генетического материала вируса Крымской-Конго геморрагической лихорадки (ККГЛ) в пробах. Разработан набор олигонуклеотидов-праймеров для идентификации вируса Крымской-Конго геморрагической лихорадки, содержащий 2 пары дезоксиолигонуклеотидов, обладающих активностью прямого и обратного праймеров в реакции обратной транскрипции и полимеразной цепной реакции со следующей структурой: 5′ agagactgaggggaagggag 3′ – PS1; 5′ aattgtcttggcacacggat 3′ – PS2; 5′ caaaaagactgtagaggctc 3′ – PS3; 5′ ttgtccgtaggttaagaatg 3′ – PS4; а также их аналоги с вырожденной структурой: Psl* 5′ -agagac(t, c)gaggggaa(a, g)ggag-3′, Ps2* 5′ aattgtcttggc (a,g)ca(t,c)ggat 3′, Ps3* 5′-caa(a, g)aagac(t,c)gt(a,g)gaggctc-3′, Ps4* 5′- ttgtccg(t,a)aggtt(a, g)ag(a, g)atg-3′ и прямой контрольный праймер со следующей структурой: Ps5 5′-ct(t, c)tcagctc(a, g)t(t, a)ctactggct-3′. Использование набора праймеров позволяет выявлять вирус ККГЛ с учетом вариаций в строении генома различных географических изолятов, циркулирующих на территории Средней Азии и .южных регионов России. 2 ил., 1 табл.

Изобретение относится к биотехнологии, в частности к генетической инженерии, и может быть использовано в медицине для выявления генетического материала вируса Крымской-Конго геморрагической лихорадки (ККГЛ) в пробах, а также для решения научно-исследовательских задач по изучению ККГЛ.

Метод обратной транскрипции – полимеразной цепной реакции (ОТ-ПЦР) является прямым методом выявления РНК вируса и имеет высокую степень чувствительности. В основе ОТ-ПЦР лежит получение кДНК на матрице вирусной РНК с помощью фермента обратной транскриптазы и многократное копирование с помощью фермента ДНК-полимеразы определенного фрагмента кДНК, являющегося маркерным для данного вида возбудителя инфекционного заболевания. Для эффективного проведения ОТ-ПЦР необходимы праймеры – синтетические олигонуклеотиды определенного размера, специфичные для каждого вида и типа вируса. Ограниченность использования праймеров обусловлена их видоспецифичностью. Праймеры должны быть комплементарны последовательностям ДНК на левой и правой границах специфического фрагмента и ориентированы таким образом, чтобы синтез ДНК, осуществляемый ДНК-полимеразой, протекал только между ними. В результате происходит экспоненциальное увеличение количества копий специфического фрагмента. От правильно выбранных праймеров, определяющих специфичность ПЦР, зависит точность диагностирования исследуемого вируса.

Однако данный набор праймеров разработан на основе структуры РНК изолятов вируса ККГЛ, циркулирующих за пределами южных регионов России и других стран СНГ и отличающихся по строению генома от вирусов, циркулирующих на территории стран СНГ, что не обеспечит надежного выявления генетического материала вируса Крымской-Конго геморрагической лихорадки (ККГЛ) в пробах, отобранных на указанных территориях.

Техническим результатом заявляемого изобретения является разработка набора праймеров для индикации генетического материала вируса Крымской-Конго геморрагической лихорадки с учетом вариаций в строении генома различных географических изолятов вируса, циркулирующих на территории республик Средней Азии и южных регионов России.

Указанный результат достигается разработкой набора олигонуклеотидов-праймеров для идентификации РНК вируса Крымской-Конго геморрагической лихорадки, содержащего 2 пары дезоксирибоолигонуклеотидов, обладающих активностью прямого и обратного праймеров в реакции обратной транскрипции и полимеразной цепной реакции, имеющих следующую структуру:
5’agagactgaggggaagggag3′ – PS1;
5’aattgtcttggcacacggat3′ – PS2;
5’caaaaagactgtagaggctc3′ – PS3;
5’ttgtccgtaggttaagaatg3′ – PS4.

В набор также включены аналоги вышеприведенных праймеров, имеющих вырожденную структуру с учетом вариаций в этих участках генома различных изолятов, в особенности из регионов России и прилегающих к ней. Праймеры имеют следующую структуру:
Ps1* 5′-agagac(t,c)gaggggaa(a,g)ggag-3′;
Ps2* 5′-aattgtcttggc(a,g)ca(t,c)ggat-3′;
Ps3* 5′-caa(a,g)aagac(t,c)gt(a,g)gaggctc-3′;
PS4* 5′-ttgtccg(t,a)aggtt(a,g)ag(a,g)atg-3′.

В набор также входит контрольный праймер Ps5, располагающийся внутри амплифицируемого района и имеющий следующую структуру:
Ps5 5′-ct(t,c)tcagctc(a,g)t(t,a)ctactggct-3′
В рамках заявляемого технического решения разработана схема выбора праймеров с учетом вариаций в строении генома различных географических изолятов вируса, циркулирующих на территории республик Средней Азии и южных регионов России. Апробация праймеров была осуществлена с использованием европейских и азиатских штаммов и изолятов вируса. Было показано, что применение данных праймеров для индикации РНК вируса ККГЛ в пробах обеспечивает синтез фрагментов ДНК рассчитанного размера в условиях ОТ-ПЦР. Специфичность продуктов амплификации была подтверждена методом прямого секвенирования.

Характеристика набора праймеров и участка амплифицируемой геномной РНК.

Праймеры фланкируют консервативный участок малого сегмента РНК вируса ККГЛ, кДНК которого имеет приблизительно одинаковое содержание нуклеотидных пар А-Т и G-C и не образует выраженных вторичных структур. Причем для большинства известных изолятов, у которых структура данного участка малого сегмента генома установлена, внутри этого участка содержится сайт рестрикции для эндонуклеазы HindIII в позиции 1127. Данное обстоятельство позволяет проводить оценку специфичности продуктов амплификации простым рестрикционным анализом. В тех случаях, когда указанный сайт отсутствует, специфичность образующегося в реакции ОТ-ПЦР фрагмента легко установить при помощи повторного проведения ПЦР с использованием в качестве матрицы полученного фрагмента и пары праймеров Ps5 (прямой) и Ps3 либо Ps3* (обратный). Причем полученный фрагмент не исключает возможности расщепления рестриктазой HindIII в случае наличия этого сайта. Безусловное доказательство возможно проведением прямого секвенирования ПЦР-фрагмента, что нами и было выполнено. Возможные вариации в геноме некоторых изолятов в местах расположения праймеров Ps1-Ps4 могут не обеспечить надежного тестирования; тогда их заменяют праймерами Ps1*Ps-4* либо во втором раунде ПЦР вместо праймера Ps3 используют Ps5 и амплифицируют фрагмент меньшей длины (335 п.о.). Таким образом, возможны различные варианты проведения ОТ-ПЦР с использованием разных праймеров из предложенного набора и оценки специфичности амплифицированного фрагмента.

Кроме того, разработаны условия ОТ-ПЦР с использованием ферментов и прибора для амплификации отечественного производства (Бис-1), что является важным обстоятельством, так как зарубежные наборы для ОТ-ПЦР чрезвычайно дорогостоящи. Технический результат: разработаны праймеры для индикации вируса Крымской-Конго геморрагической лихорадки.

Перечень графических материалов.

На фиг.1 представлена нуклеотидная последовательность участка малого сегмента РНК вируса ККГЛ (изолят HU2015, Казахстан), амплифицируемая патентуемым набором олигонуклеотидов-праймеров. Продукт амплификации соответствует отрезку нуклеотидной последовательности участка генома длиной 506 п.о. (из которых 259 составляют А-Т-пары, т.е. соотношение пар A-T/G-C, близкое к 1/1) и несет мутацию в сайте HindIII (AAGCTT=>AAGCTC).

На фиг.2 приведена электрофореграмма продуктов ОТ-ПЦР-исследования (2-й раунд амплификации) с использованием праймеров серии Ps клинических образцов (сыворотки крови больных ККГЛ) в 1,5%-ном агарозном геле.

Пример 1. Методика получения набора праймеров для выявления вируса ККГЛ в пробах
На основе теоретического изучения структуры малого сегмента РНК вируса ККГЛ были синтезированы праймеры для проведения обратной транскрипции и полимеразной цепной реакции (таблица).

В качестве контрольных праймеров синтезировали праймеры, соответствующие по первичной структуре зарубежному аналогу [1] -прототипу:
5’tggacaccttcacaaactc3′ F2 (135-153);
5’gaatgtgcatgggttagctc3′ F3 (290-309);
5’gacatcacaatttcaccagg3′ R2 (549-530);
5’gacaaattccctgcacca3′ R3 (670-653).

Отработка условий амплификации проводилась при использовании в качестве матрицы плазмидного вектора, содержащего клонированную ДНК-копию малого сегмента РНК вируса ККГЛ.

В качестве ДНК стандарта был использован плазмидный вектор, содержащий полную ДНК-копию малого сегмента РНК вируса ККГЛ, полученный из Оксфордского Института микробиологии в 1992 году.

Отработаны условия амплификации, которые были использованы для обнаружения генетического материала вируса ККГЛ в клинических образцах (препараты крови заболевших и секционный материал умерших). В качестве положительного контроля использовали музейные штаммы вируса Крымской-Конго геморрагической лихорадки (ККГЛ), адаптированные к культуре клеток SW-13.

Ниже в примерах (2-6) приведена методика индикации генетического материала вируса ККГЛ в пробах.

Пример 2. Выделение РНК вируса ККГЛ из проб (сыворотки крови, суспензии клещей):
1) 150 мкл пробы смешивают со 150 мкл раствора Д+ и выдерживают 5 мин во льду.

2) Добавляют 300 мкл смеси фенол:хлороформ:изоамиловый спирт (24:24:1), встряхивают вручную 1 минуту.

3) Центрифугируют при +4^oС 30 мин при 15000g.

4) Отбирают водную (верхнюю) фазу и помещают в новую пробирку, содержащую 300 мкл охлажденного во льду изрпропанола.

5) Образец замораживают при -70^oС (не менее 15 мин) или выдерживают 12 ч в морозильной камере.

6) Центрифугируют 10 мин при комнатной температуре при 15000g, супернатант убирают. (При выделении РНК из цельной крови осадок ресуспендируют в 100 мкл раствора Д и повторяют пункты 2-5).

7) Дважды обмывают осадок 75% этанолом (по 0,5 мл) и 1 раз 96% этанолом с центрифугированием 1 мин при 12000g при комнатной температуре.

8) Этанол сливают, пробирку переворачивают вверх дном и помещают на бумагу на 2 мин, затем высушивают осадок при комнатной температуре 20 мин.

9) Растворяют осадок РНК в 40мкл воды при энергичном всряхивании на Vortex. Примечание: состав растворов:
Д – 4 М гуанидин изоцианат
25 мМ цитрат натрия рН 7,0
0,5% саркозил
0,1 М 2-меркаптоэтанол
Хранится при комнатной температуре или при +4^oC до 1 года. Д+ -это раствор Д, содержащий 0,2М натрий ацетат рН 4,0.

Пример 3. Получение кДНК методом обратной транскрипции.

Состав реакционной смеси:
Вода – 11 мкл,
Праймер PS2 (27 о.е./мл) – 0,2 мкл
Раствор суммарный dNTP (25 мМ) – 0,8 мкл
Буфер Х10 – 2 мкл
РНК – 5 мкл.

Обратная транскриптаза – 1 мкл.

Условия проведения реакции:
37^oС – 1 час; 99^oС – 10 минут; 37^oС – 7 минут.

Пример 4. 1 раунд РТ-ПЦР.

Состав реакционной смеси:
Вода – 38 мкл
Буфер Х10 – 5 мкл
Раствор суммарный dNTP (25 мМ) – 0,6 мкл
Праймер PS2 (27 о.е./мл) – 0,2 мкл
Праймер PS1 (17,4 о.е./мл) – 0,4 мкл
кДНК – 5 мкл
taq-ДНК-полимераза – 1 мкл.

Условия проведения реакции:
94^oС – 0,5 мин; 40^oС – 1,0 мин; 71^oС – 2,0 мин – 5 циклов.

94^oС – 0,4 мин; 45^oС – 0,7 мин; 71^oС – 1,0 мин – 40 циклов.

71^oС – 5 мин.

Пример 5. 2 раунд ОТ-ПЦР.

Состав реакционной смеси:
Вода – 41 мкл
Буфер X10 – 5 мкл
Раствор суммарный dNTP (0,25 мМ) – 0,6 мкл
Праймер PS3 (27,6 о.е./мл) – 0,2 мкл
Праймер PS4 (24,4 о.е./мл) – 0,2 мкл
ДНК 1 раунда – 2 мкл
Taq-ДНК-полимераза – 1 мкл.

Условия проведения реакции:
94^oС – 0,5 мин; 49^oС – 1 мин; 71^oС – 2 мин – 5 циклов
94^oС – 0,4 мин; 50^oС – 0,5 мин; 71^oС – 0,7 мин – 35 циклов
71^oС – 5 мин.

Пример 6. Данные анализа продуктов амплификации
Анализ продуктов амплификации проводился в 1,5% агарозном геле (фиг.2). Длина полученного после двух раундов ПЦР фрагмента в случаях исследуемых образцов соответствовала расчетной, а в отрицательном контроле (сыворотка здорового человека и реакционная смесь) продукты амплификации отсутствовали.

Заявляемый набор праймеров апробирован для индикации вируса ККГЛ в сыворотке крови больных ККГЛ из южных регионов стран СНГ и показал высокую надежность и достоверность анализов.

Формула изобретения

Набор олигонуклеотдов-праймеров для идентификации вируса Крымской-Конго геморрагической лихорадки, содержащий 2 пары дезоксиолигонуклеотидов, обладающих активностью прямого и обратного прайиеров в реакции обратной транскрипции и полимеразной цепной реакции со следующей структурой:
5′ agagactgaggggaagggag 3′ – PS1; 5′ aattgtcttggcacacggat 3′ – PS2;
5′ caaaaagactgtagaggctc 3′ – PS3; 5′ ttgtccgtaggttaagaatg 3′ – PS4;
а также их аналоги с вырожденной структурой:
Ps1* 5′-agagac(t,c)gaggggaa(a,g)ggag-3′;
Ps2* 5′-aattgtcttggc(a,g)ca(t,c)ggat-3′;
Ps3* 5′-caa(a,g)aagac(t,c)gt(a,g)gaggctc-3′;
Ps4* 5′-ttgtccg(t,a)aggtt(a,g)ag(a,g)atg-3′;
и прямой контрольный праймер со следующей структурой:
Ps5 5′-ct(t,c)tcagctc(a,g)t(t,a)ctactggct-3′.

РИСУНКИ

MM4A – Досрочное прекращение действия патента СССР или патента Российской Федерации на изобретение из-за неуплаты в установленный срок пошлины за поддержание патента в силе

Дата прекращения действия патента: 21.08.2007

Извещение опубликовано: 10.03.2009 БИ: 07/2009