Патент на изобретение №2209633

(54) Т-КЛЕТОЧНАЯ ВАКЦИНА ДЛЯ ЛЕЧЕНИЯ РАССЕЯННОГО СКЛЕРОЗА

(57) Реферат:

Изобретение относится к медицине, а именно к области иммунотерапии, и касается вакцины, эффективной для торможения рассеянного склероза, способа индуцирования иммунного ответа. Изобретение включает вакцину, содержащую аттенуированные Т-клетки, выращенные в присутствии миелиновых белков, в частности в присутствии бычьих миелиновых белков. В предпочтительном варианте изобретения вакцина содержит аттенуированные Т-клетки, полученные выращиванием аутологичных циркулирующих мононуклеарных клеток в присутствии бычьих тотальных миелиновых белков, отбором и размножением Т-клеток с иммунной реакцией на миелиновые белки и аттенуацией клеток облучением. Преимущество изобретения в создании эффективного нетоксичного средства для лечения первичного или вторичного рассеянного склероза. 3 с. и 15 з.п. ф-лы, 14 ил.

Область, к которой относится изобретение
Данное изобретение относится в целом к области иммунотерапии и к терапии аутоиммунных болезней. В частности, изобретение относится к способам использования Т-клеток в качестве вакцин для лечения аутоиммунных заболеваний, включая рассеянный склероз.

Описание уровня техники
Аутоиммунными заболеваниями страдает 5-7% взрослого населения Европы и Северной Америки (Sinha AA. MT Lopez, et al., (1990) Science 248:1380-1387). Эта группа болезней имеет большие социально-экономические последствия не только потому, что им сопутствует вероятность долгой жизни, но также потому, что они поражают людей в самые продуктивные годы. Например, больные, заболевшие рассеянным склерозом (PC), это преимущественно женщины в возрасте между 18 и 40 годами.

Полагают, что аутоиммунные заболевания являются результатом неконтролируемого иммунного ответа на аутоантигены. Полагают, что напротив, те индивидуумы, в организме которых не вызывается аутоиммунный ответ на те аутоантигены, контролируют эти реакции и, как полагают, за счет “толерантности” аутоантигенов. Хотя этиология PC остается неизвестной, ряд данных подтверждает гипотезу, что аутоиммунность играет важную роль в развитии болезни (Martin R, HF McFarland. et al., (1992) Annu. Rev. Immunol. 10:153-187). Есть основание думать, что в случае PC неконтролируемый иммунный ответ есть ответ на белое вещество центральной нервной системы и, более конкретно, на белки миелина, находящиеся в белом веществе. В конце концов, миелиновая оболочка аксонов разрушается. Это может привести к параличу, сенсорному дефициту и проблемам со зрением. PC характеризуется Т-клеточным и макрофагальным инфильтратом в мозгу. В настоящее время полагают, что миелиновые белки являются мишенью иммунного ответа при PC, включая основной миелиновый белок (ОМБ), протеолипидный белок (ПЛБ), ассоциированный миелиновый гликопротеин (АМГ) и олигодендроцитный миелиновый гликопротеин (ОМГ). Также весомость доказательств увеличивает тот факт, что Т-клеточный рецептор имеет чрезвычайную гибкость, позволяющую ему реагировать на многие различные белки (Brock R, КН Wiesmuller, et al., (1996) Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 93: 13108-13113; Loftus DJ, Y Chen, et al., (1997) J. Immunol. 138:3651-3658).

Дополнительное подтверждение этой концепции получено при изучении у животных экспериментального аллергического энцифаломиелита (ЭАЭ), клиникой и патологией сходного с PC (Alvord, et al., Experimental allergic encephalomyelitis. A useful model for multiple sclerosis. New York: Alan R. Liss, 1984). Полагают, что как при ЭАЭ, так и при PC основной миелиновый белок (ОМБ), протеолипидный белок (ПЛБ) и ОМС являются основными антигенами-мишенями для аутореактивных Т-клеток (Brostoff SW and DW Mason (1984) J. Immunol 133: 1938-1942; Tabira and Kira, 1992). Ассоциированный миелиновый гликопротеин (АМГ) может быть важен в случае PC, но не вызывает ЭАЭ у подопытных животных (моделей).

Аутоиммунную природу PC следует объяснять в связи с эпидемиологией, которая подтверждает роль агента из окружающей среды. Это, по-видимому, вирус, или вирусы, или другие микробы. История природы заболевания также подтверждает, что инфекция может вызывать обострение у некоторых больных. Вопрос о роли хронической инфекции в сравнении с рецидивирующей инфекцией в качестве “подстрекателя” аутоиммунной болезни остается нерешенным. Механизм взаимодействия вирусов может представлять собой молекулярную мимикрию белка-хозяина под действием проникающих микроорганизмов.

Иммунологическая аутотолерантность, по-видимому, достигается, главным образом, за счет делеции клона аутореактивных Т-клеток в тимусе в ходе негативного отбора и после созревания периферической лимфоидной ткани. Однако даже у здоровых людей не все аутореактивные Т-клетки претерпевают делецию в тимусе. Аутореактивные Т-клетки представляют собой часть состава нормальных Т-клеток и могут быть выделены у нормальных людей без аутоиммунных заболеваний (Correale J. M McMillan, et al., (1995) Neurology 45:1370-1378). Следовательно, аутореактивные Т-клетки могут существовать на периферии, не вызывая заболевания. Это подтверждает то, что “пост”-тимусные механизмы регулируют аутореактивные Т-клетки, обеспечивая защиту от иммунологических ответов (приступов) на “свое”. Ряд механизмов являются эффективными in vivo для регулирования аутореактивных Т-клеток. Такие механизмы могут включать сети направляемой антигенами клональной Т-клеточной толерантности или регуляторные клеточные сети, которые влияют на аутореактивные Т-клетки за счет взаимодействия с их идиотипами или структурами их эрготипа в состоянии активации (Lohse AW, F Моr, et al., (1989) Science 244:820-822; Ben-Nun A, H Wekerle, and IR Cohen (1981) Nature 292:60-61; Holoshitz J, Y Naparstek, et al., (1983) Science 219:56-58; и Maron R, R Zerubavel, et al., (1983) J. Immunol. 131: 2316-2322). Механизмы, касающиеся передачи сигнала от молекул Т-клетками-мишенями, которые выявляют идиотипические взаимодействия, еще не поняты, но полагают, что они включают как CDR2, так и CDR3 гипервариабельные области Vb цепи Т-клеточного рецептора (Saruhan-Direskendi G, F Weber, et al., (1993) Eur. J. Innunol. 23:530-536). У больных PC устойчивость Т-клеток ко многим видам регуляторного контроля может быть причиной перехода аутоиммунных заболеваний в фазу хронических прогрессирующих (Correale J, W Gilmore, et al., (1996) Nature Medicine 2:1554-1360). Несколько факторов особенно затрудняют лечение PC. Например, аберрантный иммунный ответ больного на новые миелиновые антигены расширяется за период, когда кажется, что больной находится в стадии ремиссии (Correale J. M McMillan, et al., (1995) Neurology 45: 1370-1378). Кроме того, при хроническом PC, в отличие от острого заболевания, Т-лимфоциты способны осуществлять аутопрезентацию антигена без настоящей антиген-представляющей клетки, дополнительно, таким образом, увеличивая, расширяя необычный (ненормальный) ответ на миелиновые белки (Correale J, W Gilmore, et al., (1995) J. Immunol. 154:2959-2968).

Течение PC очень различно. Наиболее типично, когда болезнь характеризуют рецидивирующие четкие обострения с последующими стабильными периодами (ремиссии). Однако во многих случаях такое течение эволюционирует после нескольких лет во вторичное прогрессирующее, при котором клиническое состояние медленно ухудшается. Более того, у некоторых больных болезнь неумолимо прогрессирует с самого начала (первичный прогрессирующий PC).

Задачей иммунологической терапии является восстановить толерантность, не подавляя иммунную систему в целом и не вызывая осложнений, таких как условно-патогенная инфекция, кровотечение и рак. В отношении людей сейчас существует несколько подходов. Таковые включают обычные цитотоксические агенты (цитоксан), характеризующиеся неизбирательностью. Другие примеры включают циклоспорин и FK 506, действенный в случае цитокина IL-2 и его рецептора; облучение, которое вызывает апаптоз и гибель клеток; кортикостероиды; блокаду МНС (ГКГ), которая предотвращает антигенное связывание; блокаду инвариантного комплекса TCR-CD3; блокаду провоспалительных цитокинов и их рецепторов, таких как IL-2 и гамма-интерферон; молекулы с анти-адгезией, такие как LFA CD2; анти-Т-клеточную активацию антителом к CD4; применение противовоспалительных цитокинов, таких как IL-10, TGF-b и IL-4. Все эти способы терапии являются антиген-неспецифичными и, следовательно, не могут отличать физиологический ответ от патологического.

Подавление иммунной системы специфичным образом более желательно для регуляции ответа на аутоантигены без даун-регуляции всей иммунной системы. В последнее время было предложено и проверено несколько специфичных иммунотерапевтических методов, большинство из которых практически нецелесообразны или не работают в применении к человеку. Например, можно синтезировать пептиды с высоким сродством, которые взаимодействуют с молекулами МНС (ГКГ) класса II и предотвращают связывание пептидов вируса энцефалита, предотвращая таким образом активацию патогенных Т-клеток (A Franco et al., (1994) The Immunologist 2:97-102). Такой подход неблагоприятен, так как трудно получить эффективные концентрации пептидов ингибитора in vivo (Ishioka GY, L Adorini, et al. , (1994) J. Immunol. 152:4310-4319). По альтернативной стратегии пептиды с последовательностями, аналогичными таковым вируса энцефалита (измененные пептидные лиганды), как было показано, являются антагонистами Т-клеточных рецепторов антиген-специфичных Т-клеток, делая их нереактогенными, хотя точный механизм в настоящее время неизвестен (Jameson SC, FR Carbone, et al., (1993) J. Exp. Med. 177:1541-1550; Karin N, DJ Mitchell, et al., (1994) J. Exp. Med. 180:2227-2237; и Kuchroo VK, JM Greer, et al., (1994) J. Immunol. 153:3326-3336). Проверено пероральное введение миелина и было найдено, что оно в случае ЭАЭ вызывает состояние иммунологической толерантности, которое, как полагают, было опосредовано индукцией супрессорной Т-клетки или анергии (Weiner HL, A Friedman, et al., (1994) Аnnu. Rev. Immunol. 12:809-837; Whitacre CC, IE Gienapp, et al., (1991) J. Immunol. 147:2155-2163 и Khoury SJ, WW Hancock, et al., (1992) J. Exp. Med. 176: 1355-1364). Как оказалось, этот метод терапии эффективен для некоторых, но не для всех больных (Weiner HL, GA Mackin, et al., (1993) Science 259: 1321-1324). Самый последний эксперимент с крупноразмерной фазой II/III не выявил эффективности в случае PC с ремиссией/обострением (неопубликованные результаты).

Некоторые исследования были сосредоточены на антигене или Т-клетке, которые вызывают заболевание (поражение). Например, исследования показали, что патогенные Т-клетки, способные вызывать аутоимунные заболевания у подопытных животных, можно сделать “авирулентными” с помощью аттенюации и вводить в виде вакцин для предотвращения последующих симптомов заболевания (Cohen IR (1989) Cold Spring Harbor Symposia on Quantitative Biology 54:879-884). В этих исследованиях Т-клеточная вакцина вызывала эффективные антиидиотипическую и антиэрготипическую Т-клеточную иммунную реакцию. Недавние исследования показали, что Т-клеточная вакцинация авирулентными клетками приматов и людей, пораженных ревматоидным артритом и PC, технически осуществима и нетоксична. Также было показано, что возможно выбрать мишенью и осуществить истощение популяции аутореактивных Т-клеток, вовлеченных в аутоиммунный процесс с применением Т-клеточной вакцинации. Результаты, однако, были неопределенными (Hafter DA, Cohen IR, et al., (1992) Clin. Immunol. and Immunopathol 62: 307-313; Lohse AW, NPM Bukker, et al., (1993) J. Autoimmunity 6: 121-130; van Laar JM, AMM Miltenburg, et al., (1993) J. Autoimmunity 6: 159-167; и Zhang J, R Medaer, et al., (1993) Science 261:1451-1454). Однако эти экспериментальные исследования для PC нацеливали только активированные Т-клетки основного миелинового белка. Весьма вероятно, что ОМБ-реактивные Т-клетки представляют собой только малую группу аутореактивных Т-клеток, ответственных за прогрессирование болезни.

В настоящее время не существует эффективных способов лечения первичного или вторичного PC. Очевидно, что требуется усовершенствовать лечение PC и других аутоиммунных нарушений с помощью нетоксичного, эффективного метода, характеризующегося иммунологической специфичностью.

Сущность изобретения
Данное изобретение нацелено на недостатки предыдущей техники. Один аспект изобретения представляет собой вакцину для терапии PC. Вакцина содержит ослабленные Т-клетки. В предпочтительной форме воплощения изобретения Т-клетки в вакцине являются аутологичными. В другой предпочтительной форме воплощения изобретения Т-клетки нацелены более чем на один миелиновый белок. Другой аспект изобретения представляет собой способ лечения больных PC вакцинацией их ослабленными Т-клетками. Еще один аспект изобретения представляет собой способ приготовления вакцины, содержащей ослабленные Т-клетки, для терапии PC. В другой предпочтительной форме воплощения изобретения Т-клетки культивируют в присутствии смеси бычьих миелиновых белков.

Краткое описание фигур
На Фигуре 1A-1D (называемой в данном описании обобщенно Фигура 1) изображены показатели EDSS и изменение частоты встречаемости циркулирующих Т-клеток, реактогенных по отношению к бычьему миелину.

На Фигуре 1А-1С (называемой в данном описании обобщенно Фигура 2) показано число секретирующих гамма-интерферон и интерлейкин-2 Т-клеток, реактивных по отношению к бычьим миелиновым белкам.

На Фигуре 3A-3D (называемой в данном описании обобщенно Фигура 3) показаны изменения частоты встречаемости Т-клеток, реактивных по отношению к пептидам ОМБ, ПЛБ и ОМГ.

На Фигуре 4 показано ингибирование пролиферации посева с помощью антимиелин-реактивной Т-клеточной линии.

Фигура 5 иллюстрирует цитотоксичность антимиелин-реактивных Т-клеток.

На Фигуре 6 показана МНС (главный комплекс гистосовместимости ГКГ) – рестрикция антимиелин-реактивных Т-клеток.

Подробное описание изобретения
Определения
Антиэрготипический означает против структур в состоянии активации.

Антиидиотипический означает против свойств аутореактивной Т-клетки.

Аутореактивный означает В- или Т-клетку, которая реагирует против собственных тканей хозяина.

Как сказано выше, настоящее изобретение относится к вакцине для лечения PC, способам производства вакцины и методам ее применения. Вакцина содержит ослабленные Т-клетки, которые, как полагают, являются аутореактивными. Предпочтительно, чтобы Т-клетки получали от больного, которого будут вакцинировать. Для того чтобы создать синтетические пептиды, соответствующие характеристикам преобладающих последовательностей патогенных миелин-реактивных Т-клеток, можно применить дополнительную очистку целевых Т-клеточных последовательностей (включая последовательности для Т-клеточных рецепторов), распознаваемых антиидиотипическими и антиэрготипическими Т-клетками. Следовательно, этот подход можно использовать для того, чтобы исключить необходимость в вакцинации аутологичными Т-клетками, при которой каждому больному нужна его или ее собственная вакцина. Предпочтительно, чтобы Т-клетки больного выделялись с помощью лейкафереза. Частота встречаемости патогенных Т-клеток оценивается между 1:20000 и 1:40000 мононуклеарных клеток периферической крови (РВМС). Следовательно, для того чтобы эффективно испытать набор (спектр), необходимо получить как можно больше клеток. Лейкаферез предоставляет порядка 1 10⁹ Т-клеток. Нужно также получить достаточное количество аутологичных РВМС для того, чтобы использовать в качестве клеток-фидеров во время выращивания аутореактивных Т-клеток для роста вакцины.

Предпочтительно, чтобы РВМС культивировались в присутствии коровьих миелиновых белков или синтетических нативных человеческих миелиновых белков, в случае, когда они идентифицированы и оказались пригодными. Клетки, отвечающие на миелиновые белки, отбираются и размножаются. Это осуществляется культивированием клеток в присутствии специфичных миелиновых антигенов. Неспецифичные клетки утрачиваются в процессе.

Клетки делают ослабленными. Предпочтительно, это осуществляют, облучая клетки при 12000 рад. Так как эти Т-клетки были отобраны из-за их реактивности по отношению к миелину, то при инъекции больному они либо должны быть убиты, либо они атакуют миелин больного. Облученные клетки не замораживаются, хотя свежие клетки могут храниться замороженными и затем облучаться и применяться для будущей инъекции больному.

Больным предпочтительно вводят подкожные инъекции ослабленных Т-клеток каждые 4-6 недель. Число клеток предпочтительно равно 40000000. Однако оптимальное количество клеток может меняться в зависимости от больного. Предпочтительный интервал величин клетки/вакцинация находится между 30 и 8010⁶. Предыдущие протоколы Т-клеточной вакцинации при рассеянном склерозе и ревматоидном артрите применяли 30-6010⁶ клеток/вакцинация без серьезных побочных эффектов (van Laar JM, AMM Miltenburg, et al., (1993) J. Autoimmunity 6: 159-167; Zhang J, R Medaer, et al., (1993) Science 261:1451-1454). Прививки делали с 4-6-недельными интервалами в течение 6 месяцев и в зависимости от клинических, иммунологических и ЯМР-данных регулируют дозу и промежуток между инъекциями.

Предпочтительно, если после первых 2 прививок больные не дают клинической реакции на количество введенных миелиновых аутореактивных Т-клеток, начинают повышать вводимую дозу. Число введенных клеток можно повышать на 25% каждые 3 месяца до тех пор, пока не появятся побочные реакции. Такая постепенная эскалация может предоставить информацию о самых высоких пределах безопасности и указать интервал доз, при которых можно проводить эффективные исследования. Если никакая эскалация не требуется, инъекции проводят с 3-месячными интервалами в течение следующих 18 месяцев. Побочные реакции могут быть, например, такими как: 1) системные симптомы, которые требуют госпитализации больного; 2) фаза усиливающейся нетрудоспособности, которая повышается на два или более интервала по шкале EDSS в течение двух последовательных неврологических экспертиз; 3) число CD4+ лимфоцитов ниже 500 клеток/мм³.

Не желая связывать себя какой-либо конкретной теорией, полагают, что механизм действия вакцины представляет собой ответ организма-хозяина на вариабельную область Т-клеточного рецептора (TCR) на облученной патогенной Т-клетке, которая входит в состав вакцины. Эта область является единственной, как полагают, отличная на патогенной Т-клетке по сравнению с другими, не подвергнутыми воздействию или активированными Т-клетками. Способ, предложенный в данном описании, основан на гипотезе, что включено много V_a и V_b, семейств, так как при прогрессирующем PC наблюдается так много различных антигенных специфичных реакций и иммунодоминантный эпитоп меняется от больного к больному. Это позволяет активировать Т-клетки каждого больного против эпитопов, как было видно in vivo. Будучи инактивированы с помощью облучения, TCR становятся антигенами и индуцируют ответ либо антиидиотипического антитела, либо Т-клетки против областей V_a и V_b многих различных патогенных Т-клеток этого больного. Результатом является либо даун-регуляция или уничтожение существующих или будущих патогенных реакций. Так как это “убитая” вакцина, может быть необходимо давать бустер раз в год для того, чтобы сохранить антимиелин-специфичную Т-клеточную инактивацию или киллинг.

Пример 1
Исследуются четверо больных с точным диагнозом – вторичным прогрессирующим PC при отсутствии реакции на любое другое лечение. Возраст в интервале 32-45 лет и никакие половые критерии не применяются. Прогрессирование (болезни), по меньшей мере, на одну единицу по шкале Куртцке (Kurtzke) произошло в год перед посещением. Больные во всех остальных отношениях здоровы и у них нет других заболеваний, объясняющих их неврологическое состояние. Все больные были освобождены от иммунотерапии в течение 60 дней или стероидов в течение, по меньшей мере, 90 дней перед началом этого протокола. Двое больных никогда ранее ничем не лечились от PC.

Мононуклеарные клетки периферической крови (РВМС) получают лейкаферезом. Примерно 10⁵-10⁶ Т-клеток специфичных к миелиновому белку можно получить с помощью афереза. Чтобы получить 4010⁶ клеток для вакцинации, требуется 40-400-кратное размножение. Лекаферез осуществляют перед вакцинацией. Между первым аферезом и первой инъекцией промежуток составляет 6-8 недель.

Соответствующие образцы крови для иммунологической безопасности были получены стандартной венопункцией. Больных попросили ежемесячно сдавать 50-70 мл крови с месячными интервалами в течение трех месяцев, а затем с двухмесячными интервалами в течение 21 месяца для рутинной оценки мер безопасности и для того, чтобы определить влияние программы вакцинации на иммунную систему.

Чтобы установить аутореактивные Т-клеточные линии, РВМС культивируют в бессывороточных средах, дополненных гентамицином и стимулированных бычьими тотальными белками, приготовленными в соответствии со стандартными протоколами (Correale J, M McMillan, et al., (1995) Neurology 43:1370-1378) и стерилизованными фильтрованием через фильтр 0,22 микрона. Через 5-7 дней клетки размножают, используя 50 ед/мл рекомбинантного человеческого IL-2 (Cetus). Т-клеточные линии повторно стимулируют через 10-14 дней, применяя аутологичные облученные РВМС в качестве антиген-представляющих клеток (АРС, АПК) и бычьи миелиновые белки. Циклы рестимуляции и экспансии повторяют ежедневно до тех пор, пока реакция на миелиновые антигены, определяемая анализами пролиферации, не превысит втрое реакцию на контрольные антигены. В это время, обычно после 3-4 циклов рестимуляции и экспансии, активированные миелиновые специфичные Т-клетки отделяют от АПК (АРС), применяя градиентное разделение на фиколле, отмывают стерилизованным физиологическим раствором с фосфатным буфером (PBS) и облучают с целью ослабления (12000 рад Cs¹³⁷). Аликвоты живых клеток замораживают (перед облучением) для будущих инъекций, которые вводят каждые 6-12 недель. Для этих инъекций клетки размораживают, а затем облучают непосредственно перед прививкой.

Каждый больной получает 4010⁶ клеток, повторно суспендированных в 1 мл стерилизованного PBS и вводимых подкожно (0,5 мл в руку). Перед инъекцией аликвоту препарата Т-клеток анализируют на бактериальный рост, эндоксины, грибок, цитомегаловирус, простой герпес, аденовирус, герпевирус и микоплазмы (GMP). Кроме того, проводят кожный тест, вводя интрадермально (внутрикожно) 25000-50000 Т-клеток, взвешенных в 0,1 мл стерилизованного PBS, чтобы определить гиперчувствительность немедленного типа. Эти процедуры повторяются перед каждой вакцинацией. Больных оставляют в стационаре на первые 48 часов после вакцинации. Вакцинацию повторяют с 3-месячными интервалами у первых двух больных и с 6-недельными интервалами у вторых двух больных в течение 6 месяцев, а затем всех 4 больных вакцинируют с трехмесячными интервалами.

Проводят проточный контроль больных для того, чтобы определить, наблюдается ли развитие или улучшение неврологического расстройства и нейропсихологического профиля. Неврологическую прогрессию определяют как повышение на один или более интервалов EDSS, сохраняющиеся в течение более чем 90 дней. У всех больных определяют базовую линию и проводят ежегодно ЯМР-исследование (головной или спинной мозг, в соответствии с локализацией патологических изменений) через 12 и 24 месяца после вакцинации. Уменьшение области поражения и изменение области поражения в процентах по сравнению с базовой линией за один год и два года для отдельного больного используются в качестве параметров эффективности. Нужно проводить ЯМР-исследование больных с 3-месячными интервалами, чтобы проверить эффективность и определить дозу и частоту вакцинации. Частота встречаемости циркулирующих миелин-реактивных Т-клеток перед и после каждой инокуляции измеряется для того, чтобы определить, реципрокно ли коррелируется падение (число) этих клеток с пролиферативными реакциями (ответами) мононуклеарных клеток периферической крови на инокуляты.

Показателями для прекращения лечения являются беременность, количество CD4+ лимфоцитов меньше 500 клеток/мм³, случай токсичности III или IV степени, применение другой исследовательской или экспериментальной терапии PC, фаза увеличения нетрудоспособности, которая прогрессирует на 2 или более интервалов по шкале EDSS непрерывно в течение шести месяцев, или серьезное интеркуррентное заболевание, препятствующее лечению Т-клеточной вакциной.

Измерение иммунологической отвечаемости
Т-клеточный иммунный ответ на вакцины изучают в РВМС с применением стандартного анализа 60 час. пролиферации, и иммунные ответы сравнивают с Т-лимфобластами, которые конкурентно готовят, стимулируя РНА и оставляя в покое аутореактивные миелиновые Т-клетки (8-10 дней после последней стимуляции антиген-представляющими клетками и миелином). Частоту встречаемости Т-клеток, способных подавлять пролиферацию инокулятов измеряют, используя частотный анализ. Культуры, показывающие более чем 60%-ное ингибирование пролиферации инокулятов, считаются иммунно отвечающими Т-клеточными линиями. Антиидиотипический и антиэрготипический ответы оценивают, применяя стандартные анализы выделения Сr⁵¹. Характер секреции цитокинов антиидиотипических, антиэрготипических и миелиновых реактивных Т-клеток оценивают методами ELISA и ELISPOT. Фенотипирование регуляторной популяции и свежих РВМС изучают методом проточного цитометрического анализа.

Результаты
Были выделены антиидиотипические и антиэрготипические Т-клетки стимуляцией in vitro Т-клеток аутологичными облученными аутореактивными ПЛБ CD4+ Т-клетками. Эти антиидиотипические и антиэрготипические клоны Т-клеток экспрессируют фенотип CD8+ и лизируют in vitro клоны аутореактивных CD4+ PLP (ПЛБ) Т-клеток.

После вакцинации у трех из четырех обследуемых больных не наблюдалось изменений EDSS-показателей при последующем тестировании в течение 414 дней (больной ML), 326 дней (больной МК) или 171 дня (больной GL). Кроме того, у больных не было Т-клеточного иммунного ответа на бычий миелин. У этих трех больных наблюдалось снижение секретирующих гамма-интерферон (IFN-gamma) и интерлейкин-2 (IL-2) Т-клеток, иммунореактивных по отношению к бычьим миелиновым белкам (Фигура 2). У всех четырех больных наблюдалось также резкое уменьшение частоты встречаемости Т-клеток, реактивных по отношению к белкам ОМБ, ПЛБ и ОМГ (Фигура 3). На Фигуре 4 показано ингибирование пролиферации инокулятов антимиелин-реактивными Т-клеточными линиями. На Фигуре 5 показана цитотоксичность антимиелин-реактивными Т-клетками. На Фигуре 6 показана МНС-рестрикция антимиелин-реактивных Т-клеток.

В заключение: предыдущие данные подтверждают мнение, что Т-клетки больных хроническим прогрессирующим PC устойчивы к ряду иммуносупрессивных механизмов, так же как к иммуномодулирующим лекарствам (Correale J., W. Gilmore, et al., (1996) Nature Medicine 2:1354-1360). Эти факты представляются значимыми для создания новых альтернативных способов лечения прогрессирующего PC. Полиспецифичный иммунный ответ в этой группе больных требует, чтобы был инактивирован большой ряд антиген-специфичных Т-клеток. Этот терапевтический способ представляет собой уникальную Т-клеточную вакцину и описан в протоколе.

Объем данного изобретения не ограничивается приведенными в виде примеров вариантами его, которые даны как иллюстрация отдельных аспектов изобретения, и способы, практически эквивалентные, входят в объем изобретения. Действительно, различные модификации изобретения в дополнение к таковым, приведенным в данном описании, станут очевидны специалистам в данной области из вышеприведенного описания и приложенных чертежей. Имеется в виду, что такие модификации входят в объем формулы изобретения.

Формула изобретения

1. Вакцина, эффективная для торможения рассеянного склероза, содержащая аттенуированные Т-клетки, выращенные в присутствии нескольких миелиновых белков.

2. Вакцина по п.1, содержащая Т-клетки, выращенные в присутствии бычьих тотальных миелиновых белков.

3. Вакцина по п.2, отличающаяся тем, что она получена отбором и размножением Т-клеток с иммунной реакцией на миелиновые белки.

4. Вакцина по п.1, отличающаяся тем, что Т-клетки происходят из аутологичных циркулирующих мононуклеарных клеток.

5. Вакцина по п.1, отличающаяся тем, что Т-клетки аттенуированы облучением.

6. Вакцина по п.5, отличающаяся тем, что Т-клетки замораживают перед аттенуацией.

7. Способ индуцирования иммунного ответа, содержащий стадию введения человеку аттенуированных Т-клеток, выращенных в присутствии нескольких миелиновых белков.

8. Способ по п.7, отличающийся тем, что Т-клетки происходят из аутологичных циркулирующих мононуклеарных клеток.

9. Способ по п.7, отличающийся тем, что Т-клетки представляют собой Т-клетки, выращенные в присутствии бычьих тотальных миелиновых белков.

10. Способ по п.9, отличающийся тем, что Т-клетки получают, отбирая и размножая Т-клетки с иммунным ответом на миелиновые белки.

11. Способ по п.7, отличающийся тем, что ослабленные Т-клетки аттенуируют облучением.

12. Способ по п.7, отличающийся тем, что Т-клетки нацелены более чем на один миелиновый белок.

13. Способ по п.7, отличающийся тем, что Т-клетки вводят подкожно.

14. Способ по п.7, отличающийся тем, что Т-клетки вводят с интервалами 4 – 6 недель.

15. Способ по п.7, отличающийся тем, что Т-клетки вводят в течение примерно 18 месяцев.

16. Способ по п.7, отличающийся тем, что первая вводимая доза Т-клеток составляет 3010⁶ – 8010⁶ аттенуированных Т-клеток.

17. Способ по п.16, отличающийся тем, что вводят более чем одну дозу, при этом вводимые позднее дозы увеличиваются, если нет клинической реакции на первую дозу, до появления побочных реакций или клинической реакции.

18. Вакцина, эффективная для торможения рассеянного склероза, содержащая аттенуированные Т-клетки, которые получены: выращиванием аутологичных циркулирующих мононуклеарных клеток в присутствии бычьих тотальных миелиновых белков; отбором и размножением Т-клеток с иммунной реакцией на миелиновые белки; и аттенуацией Т-клеток облучением.

РИСУНКИ

MM4A – Досрочное прекращение действия патента СССР или патента Российской Федерации на изобретение из-за неуплаты в установленный срок пошлины за поддержание патента в силе

Дата прекращения действия патента: 19.09.2009

Извещение опубликовано: 20.09.2010 БИ: 26/2010