Патент на изобретение №2208792

(54) СПОСОБ ОЦЕНКИ ЭНДОТОКСИНЕМИИ У ДЕТЕЙ С АТОПИЧЕСКИМ ДЕРМАТИТОМ

(57) Реферат:

Изобретение относится к медицине, в частности к детской дерматологии. Сущностью изобретения является определение уровня антител к гликолипиду граммотрицательных бактерий иммуноферментным методом и при уровне антител (38,710,9) мкг/мл определяют наличие эндотоксимии. Техническим результатом является оценка эндотоксинемии у детей с атопическим дерматитом.

Изобретение относится к медицине, к детской дерматологии.

Большую медико-социальную значимость атопического дерматита (АтД) придает рост заболеваемости, хроническое течение с частыми рецидивами, сочетанная полиорганная патология внутренних органов, присоединение вторичной микрофлоры. Заболевание часто приобретает резистентные формы к терапии и в последние годы стало приводить к инвалидности детей. Вышесказанное требует поиска новых патогенетических вариантов АтД.

Цель изобретения – разработка нового механизма патогенеза атопического дерматита (АтД) у детей старшего возраста путем установления роли эндотоксина (Э) при АтД, определения уровня антител к гликолипиду (ГЛП).

Эндотоксин – компонент клеточной стенки большинства грамотрицательных бактерий. Он считается одним из самых патогенных известных бактериальных токсинов, оказывающим многочисленные патофизиологические эффекты и системные реакции. В физиологических условиях в человеческом организме Э находится в кишечнике, незначительная часть его попадает в портальный кровоток.

Э представляет собой комплекс, состоящий из липосахарида (ЛПС), протеиновых и фосфолипидных форм. ЛПС имеет исключительно бактериальное происхождение, он высвобождается при гибели грамотрицательных микроорганизмов и в процессе роста и размножения бактерий кишечника. ЛПС состоит из трех компонентов: липида А, ядра и О-полисахарида. Структурная единица ЛПС, состоящая из липида А и внутренней части ядра, получила название гликолипида (ГЛП).

Антитела (AT) могут вырабатываться ко всем трем регионам ЛПС, но наиболее иммуногенной является О-полисахаридная часть молекулы, вариабельность которой обуславливает разнообразие антител, образующихся при инфицировании различными штаммами грамотрицательных организмов. Эти AT являются штаммспецифичными и плохо реагируют с ЛПС других организмов. Установлено, что наряду с ними всегда образуются AT к наиболее консервативной части эндотоксиновой молекулы – ГЛП, это позволяет расценивать их как универсальный маркер ответной реакции организма на системную эндотоксинемию.

В доступной нам литературе не было найдено материалов по использованию определения антител к ГЛП как составляющей эндотоксинемии в патогенезе АтД. Поэтому можно утверждать, что наша заявка обладает приоритетом.

Динамика содержания антител к гликолипиду определялась иммуноферментным анализом по следующей методике.

Забор крови у исследуемых больных и здоровых осуществлялся в стерильные пробирки, которые подвергались двухкратному центрифугированию в течение 15 минут со скоростью 1,5-2 тысяч оборотов и в течение 15 минут со скоростью 5 тысяч оборотов. Полученная плазма замораживалась при температуре – 10-20^oС.

Постановка реакции осуществлялась на специальных планшетах. В каждую лунку с помощью дозиметра раскапывались по 0,01 плазмы. В последний ряд планшета заливалась контрольная плазма с известным титром антител в различных разведениях (в 2, 4, 6, 16, 32, 64, 128, 256 раза).

В каждую лунку добавлялось 0,19 мл ЗФР с твином и ставилось на 1 час инкубироваться в термостат при 37^oС. Затем 3 раза промывают планшет ЗФР в бачке с игольчатыми насадками и 3 раза дистиллированной водой. ЗФР готовится в 10-кратной концентрации таким образом: берется 20,4 г КН₂РО₄ на 1 литр, NaHPО₄12Н₂О 53,7 г на 1 литр, который приливают до рН 7,2-7,4 и получают фосфатный буфер, затем берут 42,5 г NaCl и 0,5 л фосфатного буфера, затем 500 мл раствора добавляется 2,5 мл твина (предварительно нагретого в водяной бане для уменьшения вязкости) и 0,45 мл консерванта тимеросаля. Приготовленный раствор перед использованием разводится в 10 раз. После этого в каждую лунку закапывали по 0,110 мл конъюгата, 1 ампула которого разводится в 12 мл ЗФР непосредственно перед реакцией. Готовится раствор хромогена в субстратном буфере, в составе которого 12 мл субстратного буфера 0,02 мл спиртового желтого раствора и 0,080 мл H₂O₂ – перекиси водорода. Желтый раствор получается при добавлении 1 мл спирта в 1 флакон хромогена. Затем в каждую лунку добавляется по 0,1 мл приготовленного раствора, ставится в термостат на 20 минут или оставляется при комнатной температуре. Через 20 минут добавляется 0,05 мл Н₂О₂ и реакция останавливается. Измерение показателей производилось на иммуноферментном анализаторе. Показания прибора заносились в протокол опытов. После этого строилась калибровочная кривая на основе значений контрольной плазмы и по ней определялись значения в мкг/мл. Каждый показатель уменьшался в 2 раза и так до 256 разведения, и вычислялись из всех разведений Log и строился график.

Обследовано в стадии обострения АтД 52 ребенка, из них мальчиков было 25, а девочек – 27. В возрасте от 10 до 12 лет было 22 ребенка, от 13 до 17 лет – 30. Контрольную группу составили 30 практически здоровых детей без аллергических измененной реактивности и очагов хронической инфекции. Из них мальчиков было 14 человек, девочек – 16. Детей от 10 до 12 лет было 9, в возрасте от 13 до 17 лет – 21 человек.

В период обострения АтД был установлен уровень антител к ГЛП – 38,710,9 мкг/мл, а в период ремиссии уровень антител снижался до 14,54,1 мкг/мл (р < 0,001). В контрольной группе уровень антител к ГЛП был 11,03,6 мкг/мл (р < 0,001).

У девочек в обострении уровень антител превышал аналогичные показатели мальчиков: 42,1 17,9 и 34,312,6 мкг/мл, сохраняя соотношения и в ремиссии – 14,87,3 и 13,911,2 мкг/мл соответственно.

В период обострения уровень антител к ГЛП у детей от 10 до 12 лет был выше (43,518,9 мкг/мл), чем у детей в возрасте от 13 до 17 лет (34,913,9 мкг/мл). В период ремиссии подобные соотношения показателей сохранялись – 14,89,4 и 13,99,4 мкг/мл соответственно.

Таким образом, в период обострения АтД у детей старшего возраста уровень антител к ГЛП был выше, чем в контрольной группе. У девочек и детей в возрасте от 10 до 12 лет показатели превышали уровень у мальчиков и детей более старшего возраста. В стадии ремиссии имелось снижение уровня антител, близкого к показателям контрольной группы.

Полученные данные позволяют сделать заключение об участии ГЛП в патогенезе АтД, изменениях уровня антител к нему в зависимости от возраста и пола. Использование иммуноферментного анализа для определения уровня антител к ГЛП является целесообразным при АтД.

Рассмотрим истории болезни детей.

Пример 1. Больной Федосеев А., 12 лет, и/б 386, был госпитализирован в стационар ВКВД 27 марта, 1995 г. с жалобами на появление сыпи, зуда на туловище, лице и конечностях в течение 2-х недель.

Впервые заболел в 7 месяцев, когда на фоне прикорма искусственного питания появились очаги на лице и волосистой части головы, в дальнейшем распространившиеся по туловищу и конечностям. После приема медикаментов и соблюдения диеты сыпь исчезла. С 1,5 лет отмечаются аллергические реакции на холод и пищевые продукты (шоколад, курицу, цитрусовые). Постепенно кожный процесс распространялся, с 1990 г. отмечаются ежегодные неоднократные обострения в осенне-весенний период. Ухудшение связывают с учебой, стрессами в школе, нарушениями в диете. Стационарное лечение в 1990 г. привело к временному улучшению.

Родился от 1-й беременности, роды 1-е, срочные, в срок 40 недель, с ростом 58 см, массой 4300 г. У матери отмечались отеки, проводилось переливание крови и плазмы. На естественном вскармливании был 4 месяца, прикорм в срок. После 4-х месяцев – на искусственном вскармливании (смеси, кисломолочные продукты, консервы).

В период новорожденности были диагностированы абсцесс правого века, дакриоцистит, пиодермия, аллергическая реакция после ванны с чередой, дисбактериоз, дискинезия желчевыводящих путей, фарингит, острицы, корь, краснуха, ветряная оспа, частые ОРЗ. При обследовании ФГДС – эрозивный гастрит, дуоденальногастральный рефлюкс, УЗИ – мелкозернистые изменения в структуре печени.

Живет с родителями в благоустроенной, сухой, светлой квартире. Ученик 6 класса. У отца – в анамнезе язвенная болезнь желудка, курит. У бабушки со стороны отца – лекарственная аллергия, псориаз. Дома из потенциальных аллергенов присутствуют ковры, книги на открытых полках, перьевая подушка и шерстяное одеяло ребенка, собака.

При объективном осмотре выявлены бледность, сухость кожных покровов вне очага поражения, увеличение до 2 см передних и задних шейных лимфатических узлов, обложенный сероватым налетом по центру язык. Кожный процесс локализовался на лице, туловище, конечностях. На щеках эритэма, чешуйки, заезды в правом углу рта, веки отечные, шелушение, вокруг глаз – гиперпигментация. За ушами и в области мочек трещины, геморрагические корочки, шелушение. На туловище округлые очаги депигментации, шелушение на фоне гиперемии, расчесы. На конечностях – в локтевых, подколенных, лучезапястных сгибах, предплечьях, кистях имеется выраженная инфильтрация, лихенификация, эпидермальнодермальные и пруригинозные папулы, шелушение, трещины, расчесы.

Выставлен диагноз: атопический дерматит смешанной этиологии, диффузный, пруригинозный, выраженной степени активности, тяжелое течение, пищевая аллергия.

Проведенные исследования крови установили уровень AT к ГЛП до проведения лечения 51 мкг/мл. В контрольной группе уровень антител к ГЛП был 11,03,6 мкг/мл.

Назначена гипсалиергенная диета, очистительная клизма, уголь активированный, тавегил, но-шпа, микстура с бромом, аскорбиновая кислота, пангамат кальция, акупунктура. После лечения наступило значительное улучшение кожного процесса.

После проведенной терапии уровень антител к ГЛП был 7 мкг/мл.

Пример 2. Кадыров И., 15 лет. На амбулаторном приеме 5 апреля 1995 г. – жалобы на сыпь, зуд, утолщение и сухость кожи в складках около недели.

Впервые заболел в 3 месяца, когда появились элементы сыпи на лице, коже живота, груди. В возрасте 3-4 года отмечались аллергические реакции на шоколад, кофе, цитрусовые, рыбу, антибиотики, сульфаниламиды, димедрол. Проводилось эпизодическое амбулаторное и самостоятельное медикаментозное лечение (антигистаминные мази). Отмечаются обострения несколько раз в год в осенне-весенний период. Ухудшение связывает с нарушениями в диете, стрессами, приемом алкоголя.

Родился в срок 40 недель от 1-й беременности, роды 1-е, затяжные, с длительным безводным периодом. Во время беременности у матери отмечались токсикоз 1-й половины беременности, длительное нервное напряжение. Масса при рождении 4300 г, рост 58 см. На естественном вскармливании был до 2 месяцев, затем переведен на смеси, кисломолочные продукты, творог, консервы. В период новорожденности не болел. Перенесенные заболевания – дискинезия желчевыводящих путей, ветряная оспа, черепно-мозговая травма с потерей сознания на 15 минут, частые ОРЗ. При обследовании ФГДС – дуоденальнобульбарногастральный рефлюкс, гастрит, птоз желудка, УЗИ – хронический холецистит.

Живет с родителями, сестрой и бабушкой в отдельной темной, теплой, сухой квартире в панельном доме. На полу окрашенные краской древесноволокнистые плиты, покрытые синтетическими коврами. Мать страдает экземой, пищевой аллергией, язвенной болезнью желудка. Дома из потенциальных аллергенов ковры, книги на открытых полках, перьевая подушка и шерстяное одеяло ребенка. Курит 2 года, выкуривает по 1 пачке сигарет в течение 2-х дней.

При объективном обследовании кожные покровы сухие, лимфоузлы (более 1,5 см), безболезненны. Язык обложен серо-желтым налетом. Ротовая полость санирована. Умеренная болезненность в эпигастрии. Кожный процесс локализуется на лице, шее, туловище, конечностях. На лице пигментированные участки, отечность и шелушение век. На задней поверхности шеи массивная инфильтрация, лихенификация, плоские дермальные папулы по периферии. На туловище также имеется пигментация, геморрагические корочки и экскориации, гиперемия, шелушение. На крупных сгибах очаги лихенизации, инфильтрации, везикулезно-папулезные высыпания, геморрагические корочки, шелушение, гиперемия.

Выставлен диагноз: атопический дерматит смешанной этиологии, лихеноидная форма, распространенный, выраженной степени активности, тяжелое течение.

Уровень AT к ГЛП в крови до лечения был установлен в 81 мкг/мл. В контрольной группе уровень антител к ГЛП был 11,03,6 мкг/мл.

Была назначена гипоаллергенная диета, очистительная клизма, уголь активированный, тавегил, фестал, аскорбиновая кислота, глюконат кальция, пантотенат кальция, акупунктура. После лечения наступило клиническое улучшение кожного процесса.

После проведенной терапии уровень AT снизился до 8 мкг/мл.

Пример 3. Сагитова А., 15 лет, на амбулаторном приеме 27 февраля 1995 г. , жалобы на сухость кожи, высыпания на лице, локтевых сгибах, зуд в течение недели.

Впервые заболела в 6 лет. Высыпания появились на лице, сгибах рук. После эпизодического амбулаторного лечения отмечала улучшение. Самолечение мазями. Последние 3 года отмечает частые обострения в весенне-осенний период, после погрешностей в диете, стрессах.

Родилась от 1-й беременности, роды 1-е, с массой 4200 г, ростом 54 см. В течение беременности у матери отмечалось повышенное артериальное давление, злоупотребление сладким. На естественном вскармливании до 11 месяцев, прикорм с 5 месяцев (овощное пюре, с 6 – каши, с 8 – творог, кефир).

Перенесла аллергическую реакцию в возрасте 3-х месяцев на АКДС в виде распространенной сыпи на туловище, а также ветряную оспу, дискинезию желчевыводящих путей, дисбактериоз. При обследовании ФГДС – хронический гастрит, УЗИ – уплотнение по ходу сосудов печени, снижение тонуса желчного пузыря.

Проживает с родителями в отдельной светлой, сухой, теплой квартире, в кирпичном доме. На полу синтетические ковры. У матери в анамнезе хронический гастрит.

При объективном осмотре умеренная болезненность в эпигастрии. Кожный процесс локализуется на лице и локтевых сгибах, симметричный, локализованного характера. На лице пигментация, сухость, шелушение щек и век, гиперемия. В локтевых и подколенных сгибах – лихенификация, инфильтрация, гиперемия, везикулезно-папулезные высыпания по периферии очагов.

Выставлен диагноз: атопический дерматит смешанной этиологии, лихеноидная форма, распространенный, выраженной степени активности, тяжелое течение.

Уровень AT к ГЛП в крови до лечения был установлен в 89 мкг/мл. В контрольной группе уровень антител к ГЛП был 11,03,6 мкг/мл.

Была назначена гипоаллергенная диета, очистительная клизма, уголь активированный, тавегил, фестал, аскорбиновая кислота, глюконат кальция, пантотенат кальция, акупунктура. После лечения наступило клиническое выздоровление.

После проведенной терапии уровень AT к ГЛП снизился до 8 мкг/мл.

Как видно из приведенных примеров уровень антител к ГЛП, изначально превышающий контрольные показатели, после терапии снизился в 7-11 раз, что говорит об участии эндотоксинемии в патогенезе АтД.

Формула изобретения

Способ оценки эндотоксинемии у детей с атопическим дерматитом путем иммунологического анализа, отличающийся тем, что определяют иммуноферментным анализом уровень антител к гликолипиду граммотрицательных бактерий и при уровне антител (38,710,9) мкг/мл определяют наличие эндотоксинемии у детей с атопическим дерматитом.

MM4A Досрочное прекращение действия патента Российской Федерации на изобретение из-за неуплаты в установленный срок пошлины за поддержание патента в силе

Дата прекращения действия патента: 01.04.2001

Номер и год публикации бюллетеня: 18-2004

Извещение опубликовано: 27.06.2004