Патент на изобретение №2208641

(54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ПОЛИПЕПТИДА, СПЕЦИФИЧНОГО К ЗАВЕЗЕННОМУ МУРАВЬЮ РИХТЕРА, ПОЛИПЕПТИД, СПОСОБ УНИЧТОЖЕНИЯ МУРАВЬЯ РИХТЕРА

(57) Реферат:

Изобретение относится к области биотехнологии, в частности к биоинженерному продукту для борьбы с муравьями Рихтера и способу получения данного продукта. Используют методики иммунологической и генной инженерии для создания моноклональных антител mAb, а также вирусов (фагов), которые проявляют scFv фрагменты тяжелой и/или легкой цепи Ig, показывающие высокоавидное специфическое связывание с клетками микроворсинок средней кишки матки завезенных муравьев Рихтера. Специфические моноклональные антитела и фаги, проявляющие Fab фрагменты антител, соединяются с токсинами для целевой доставки и поражения маток завезенных муравьев Рихтера и уничтожают их, но при этом не затрагивая естественные виды. Использование изобретения позволяет восстановить естественную экосистему за счет избирательного действия полученного полипептида. 3 с. и 3 з.п.ф-лы, 1 ил.

Область техники
Данное изобретение относится к иммунологии и генной инженерии. В частности, данное изобретение относится к иммунологической инженерии, а именно к созданию новых реагентов, которые осуществляют целевое отравление молекул поверхности клеток в клетках микроворсинок средней кишки у матки завезенных муравьев Рихтера.

Уровень техники
Завезенные муравьи Рихтера являются экологическим и финансовым бедствием для Техаса, а также других штатов в южной части Соединенных Штатов. Завезенные муравьи Рихтера были случайно завезены в США в 30-х годах XX века. Эти вредители полностью расстроили и разрушили естественные экосистемы и оказали неблагоприятное экономическое воздействие на сельское хозяйство (большие муравейники стали причиной повреждения оборудования), скотоводство (потери новорожденного скота) и отдых и туризм (сокращение количества дичи и приведение парков и курортов, в лучшем случае, в плохое состояние).

Определенная проблема контроля популяций муравьев Рихтера состоит в том, как найти возможность контролировать и сокращать виды завезенных насекомых, не нанося вреда естественным видам насекомых. Эта проблема касается множества неестественных видов животных, которые были завезены во все части Соединенных Штатов. Ввезенные виды часто являются более конкурентоспособными, чем естественные виды, так как во многих случаях у них развита улучшенная репродуктивная способность и они не имеют естественных врагов в новых условиях окружающей среды [1]. Таким образом, важно ликвидировать завезенные виды. С другой стороны, естественные виды не должны быть уничтожены, так как естественный баланс имеющейся экосистемы включает присутствие таких естественных видов.

В настоящее время известный уровень техники включает различные методики контроля популяции муравьев Рихтера. Химические отравляющие вещества, такие как AMDRO, хорошо известны в данной области техники и часто используются. Такие яды, однако, могут приводить к загрязнению окружающей среды и беспорядочно уничтожать как естественные, так и завезенные виды.

Таким образом, известный уровень техники не располагает данными о продукте, способном искоренить завезенных муравьев Рихтера, который является не вредным для окружающей среды и который избирательно уничтожает только завезенных муравьев Рихтера. Данное изобретение полностью удовлетворяет долголетнюю необходимость и потребность настоящего уровня техники.

Краткое описание изобретения
Данное изобретение относится к биоинженерному продукту для борьбы с муравьями Рихтера, который является безопасным, выгодным с точки зрения “цена-качество”, экологически совместимым и безопасным для окружающей среды, и способу получения такого продукта. Методики иммунологической и генной инженерии используются для создания моноклональных антител (мАтл) и получаемых при этом фрагментов Fab, а также вирусов (фагов), которые проявляют фрагменты антител, называемые одинарными фрагментами тяжелой или легкой цепи V-гена (scFv) или scFv фрагментами тяжелой и легкой цепи (Fab), которые демонстрируют высокоавидное специфическое связывание с клетками микроворсинок средней кишки матки завезенных муравьев Рихтера. Определенные моноклональные антитела и фаги, проявляющие scFv и Fab фрагменты антител, конъюгируют с токсинами (гелонин, бактериальные эндотоксины или другие токсины), или кодирующую кДНК для про-апоптозных индукторов, блокаторов клеточного цикла, ингибиторов пролиферации клеток, индукторов дифференциации, лигируют с ScFvFab фрагментами для целевой доставки и уничтожения матки завезенных муравьев Рихтера, не затрагивая при этом естественные виды, что позволяет восстановить естественную экосистему. Более того, биспецифические Fab или scFv с одним плечом Fab, проявляющим специфичность к целевому внеклеточному домену клеточной мембраны, и с другим плечом Fab, проявляющим специфичность к гелонину, бактериальному эндотоксину или другим токсинам, обеспечивают еще один новый способ определенной целевой доставки токсинов. Области, кодирующие последовательность ДНК ферментно-активного домена гелонина, бактериального эндотоксина или других токсинов, введенные в ДНК, кодирующие определенные scFv фрагменты легкой или тяжелой цепи Ig или Fab фрагменты Ig, представляют другой способ целевой доставки токсинов.

Одним объектом данного изобретения является определенный способ управления и контроля насекомых-вредителей, которые не наносят ущерб окружающей среде и не вредят естественным видам животных.

В одном варианте данное изобретение представляет композиции, которые определенным образом доставляют про-апоптозные ингибиторы клеточного цикла в целевые клетки.

В еще одном варианте данное изобретение представляет композицию для доставки токсинов и ингибиторов роста клеток в целевые клетки.

В еще одном варианте данное изобретение представляет способ получения реагентов, которые направляют яды в целевые клетки, но не затрагивают нецелевые клетки, включающий иммунизацию животного указанными целевыми клетками для получения моноклональных антител; сбор обогащенных клеток селезенки; гибридизацию указанных клеток селезенки со сливающимися клетками миеломы с помощью полиэтиленгликоля; селекцию клеток гибридомы выращиванием на среде HAT; скрининг надсадочных жидкостей гибридомы для получения мышиных антител, используя методику ELISA и для придания антителу специфичности к антигенам микроворсинок средней кишки, используя иммуногистологические методики; клонирование ограниченным разведением, скрининг надсадочных жидкостей гибридомы, экспансию клонов и замораживание положительных клонов; и получение гибридом, вырабатывающих стабильные, моноклональные антитела, для получения надсадочных жидкостей или жидких асцитов, или получения очищенного моноклонального антитела.

В еще одном варианте данное изобретение представляет способ уничтожения муравьев Рихтера, включающий стадию контактирования указанных муравьев с полипептидом, полученным по описанному в данном изобретении способу.

Другие и остальные варианты, особенности и преимущества данного изобретения будут понятны из следующего описания предпочтительных вариантов. Эти варианты даны для раскрытия данного изобретения.

Краткое описание чертежей
Для того чтобы перечисленные выше особенности, преимущества и объекты данного изобретения, а также другие аспекты, которые станут более ясными из дальнейшего описания, могли быть подробно рассмотрены, более конкретное описание данного изобретения, коротко изложенного выше, может быть сделано с помощью его определенных вариантов, которые иллюстрированы в приложенных чертежах. Эти чертежи представляют собой часть данного описания. Однако должно быть отмечено, что приложенные чертежи иллюстрируют только предпочтительные варианты данного изобретения и поэтому не должны считаться ограничивающими объем данного изобретения.

На чертеже схематически изображены способы данного изобретения, включая иммунное примирование; получение кДНК; создание библиотеки фагов; селекцию фагов; проверку определенных scFv и Fab; и их тестирование.

Подробное описание изобретения
В данном описании термин “моноклональное антитело” или “mAb” относится к антителу, содержащему тяжелую или легкую полипептидную цепь, специфичному к целевым клеткам, которое генерировано и выбрано из клонированной клетки, вырабатывающей антитела.

В данном описании термин “фрагмент антитела” или “Fab” относится к частицам минимального размера на основе иммуноглобулина, которые способны быть распознаны, сегментам V-гена тяжелой и легкой цепей иммуноглобулина, которые демонстрируют высокую степень родства с целевыми антигенами.

В данном описании термин “scFv” фрагмент относится к частицам минимального размера на основе иммуноглобулина, которые способны быть распознаны, фрагменту тяжелой или легкой, или сочетанием тяжелой и легкой цепи Ig V-гена с высокой степенью родства с целевой клеткой.

В данном описании термин “биспецифическое антитело” относится к полученным либо химически, либо с помощью технологий ДНК, Fab или scFv фрагментам иммуноглобулина со специфичностью к двум различным антигенным детерминантам, т. е. к одному плечу единицы специфичности Ig, взаимодействующему с целевым антигеном, и к другому плечу, специфично взаимодействующему с токсинами, такими как гелонин или бактериальные эндотоксины.

В данном описании термин “токсин” относится к любому химическому соединению, которое ведет себя токсическим образом, убивая клетки при введении в целевые клетки, которое доставляется тремя определенными механизмами: химическим связыванием с целевым фрагментом Ig, с помощью технологии биспецифического Fab или с помощью технологии ДНК с получением цитотоксического домена scFv токсина тяжелой цепи. Примером такого токсина является гелонин, хорошо известный белок, инактивирующий рибосому или его рекомбинантные формы.

В данном описании термин “библиотека фагов” относится к спектру, насчитывающему до 2 х 108 независимых клонов Fab или scFv фрагментов иммуноглобулина.

В данном описании термины “про-апоптозный”, “блокаторы клеточного цикла”, “ингибиторы пролиферации клеток” и “агенты пролиферации клеток” относятся к кДНК генов, которые контролируют пролиферацию клеток, клеточный цикл, дифференциацию клеток и смерть клеток, которые лигированы к моноклональным Fab фрагментам или scFv фрагментам тяжелой и/или легкой цепи Ig для специфической доставки в целевые клетки. В данном описании термины “Fab, проявленный фагом” и “scFv, проявленный фагом” относятся к спектру Fab и scFv фрагментов тяжелой и/или легкой цепи Ig, которые проявлены на фаге и отобраны через связывание антигена с целевой клеткой.

Согласно данному изобретению могут быть использованы обычные методики молекулярной биологии, микробиологии и рекомбинантной ДНК, имеющиеся в данной области техники. Такие методики подробно описаны в литературе. Например, Maniatis, Fritsch & Sambrook, “Molecular Cloning: A Laboratory Manual” (1982); “DNA Cloning: A Practical Approach”, том I и II (D.N. Glover ed. 1985); “O1igonucleotide Synthesis” (M. J. Gait ed. 1984); “Nucleic Acid Hybridization” (B. D. Hames & S.J. Higgins eds. (1985)); “Transcription и Translation” (B.D. Hames & S.J. Higgins eds. (1984)); “Animal Cell Culture” (R. I. Freshney, ed. (1986)); “Immobilized Cells и Enzymes” (IRL Press, (1986)); B. Perbal, “A Practical Guide To Molecular Cloning” (1984).

“Вектор” представляет собой репликон, такой как плазмид, фаг или космида, к которому может быть присоединен сегмент ДНК таким образом, чтобы вызвать репликацию присоединенного сегмента. Вектор является “фармакологически приемлемым”, если его введение может переноситься млекопитающим реципиентом. Можно сказать, что такой агент вводится в “терапевтически эффективном количестве”, если введенное количество является физиологически значительным. Агент является физиологически значительным, если его присутствие приводит к изменению физиологии млекопитающего реципиента. Например, при лечении ретровирусной инфекции соединение, которое снижает степень заражения или физиологический ущерб, причиненный инфекцией, будет считаться терапевтически эффективным.

Клетка “трансформируется” экзогенной или гетерологической ДНК, когда такая ДНК вводится внутрь клетки. Трансформированная ДНК может быть или может не быть интегрирована (ковалентно связана) в геном клетки. В прокариотах, дрожжах или клетках млекопитающих, например, трансформированная ДНК может сохраняться на эписомальном элементе, таком как плазмида. В отношении эукариотических клеток, устойчиво трансформированная клетка является одной из тех, в которых трансформированная ДНК интегрирована в хромосому таким образом, что она наследуется дочерними клетками во время репликации хромосомы. Такая стабильность продемонстрирована возможностью эукариотической клетки создавать линии клеток или клоны, содержащие популяцию дочерних клеток, содержащие трансформированную ДНК. “Клон” представляет собой популяцию клеток, полученных из одной клетки или общего предка с помощью митоза. “Линия клеток” представляет собой клон или первичную клетку, способную к стабильному росту in vitro во многих поколениях.

Последовательности транскрипционного и трансляционного контроля представляют собой регуляторные последовательности ДНК, такие как промоторы, энхансеры, сигналы полиаденилирования, терминаторы и подобные, которые обеспечивают экспрессию кодирующей последовательности в клетке хозяина.

“Молекула ДНК” откосится к полимерной форме дезоксирибонуклеотидов (аденина, гуанина, тимина или цитозина), либо в виде одной цепи, либо в виде двойной спирали.

Этот термин относится только к первичной и вторичной структуре молекулы и не ограничивает ее до любых определенных третичных форм. Таким образом, этот термин включает ДНК с двойной спиралью, найденную среди прочих, в линейных молекулах ДНК (например, фрагменты рестрикции), вирусах, плазмидах и хромосомах. При обсуждении структуры в данном описании обычно имеются в виду только последовательности в направлении 5′–>3′ вдоль нетранскрибированной цепи ДНК (например, цепи, имеющей последовательность, гомологичную мРНК).

Данное изобретение относится к продукту, предназначенному для искоренения муравьев Рихтера, который является безвредным для окружающей среды и специфически поражает и уничтожает только завезенных муравьев Рихтера. Кроме того, предполагается, что способ данного изобретения может быть применен для специфического поражения любых животных-вредителей.

Получение и скрининг моноклональных антител с высокой степенью авидности к определенным антигенным эпитопам является утвержденной и стандартной лабораторной методикой. Методика ДНК, хорошо известная специалисту в данной области, позволяет вводить ДНК, кодирующую небольшие единицы распознавания иммуноглобулина (называемые фрагментами антител, т.е. N-концевые вариабельные домены с тяжелых и легких цепей иммуноглобулина, которые проявляют ту же антигенную специфичность, что и интактные большие родительские антитела), в векторы экспрессии вируса (фаги), которые вырабатывают и проявляют тяжелые и легкие цепи scFv и комбинации тяжелой и легкой цепи Ig на своей поверхности [2-9]. Эта технология использовалась для определенных целевых клеток опухоли для выборочного уничтожения; однако на сегодняшний день эта технология не применяется для специфического поражения с целью уничтожения насекомых-вредителей или других животных-вредителей.

Методика проявляющих фагов имеет основное преимущество над традиционными моноклональными антителами, заключающееся в том, что большой и разнообразный спектр scFv v-генов тяжелой или легкой и комбинации тяжелой и легкой цепей Ig может быть выработан и экспрессирован на поверхность вируса, таким образом давая возможность быстрого скрининга и отбора scFv фрагментов с высокой степенью авидности (тесного связывания) с целевой специфичностью. Важно то, что как только определенные проявленные фагом scFv фрагменты Ig будут выбраны на основе специфичности к антигенному эпитопу, ДНК, которая кодирует определенный Fab фрагмент, становится доступной для генетически полученного ферментно-активного домена гелонина, бактериальных эндотоксинов или других токсинов, генов, программирующих смерть клетки (апоптозных), а также генов, которые нарушают пролиферацию клеток в Fab ДНК. Таким образом, получают целевую систему, которая доставляет определенные токсины, агенты, вызывающие апоптоз, или ингибиторы пролиферации клеток, или агенты, вызывающие дифференциацию клеток. Получение ферментно-активного гелонина или бактериальных эндотоксинов, или других продуктов, включающих гены, убивающие клетки, имеющих scFv или Fab фрагменты Ig с целевой специфичностью, дает новый способ целевой доставки продуктов, вызывающих смерть клетки.

В данном изобретении использованы методики иммунологической и генной инженерии, используемые для получения моноклональных антител и вирусов (фагов), которые проявляют scFv и Fab фрагменты Ig, выбранные для взаимодействия с клетками микроворсинок средней кишки матки завезенных муравьев Рихтера, но которые не взаимодействуют с клетками микроворсинок матки естественных муравьев Рихтера. Эти scFv и Fab фрагменты Ig и их специфичность не ограничены только применением на микроворсинках матки завезенных муравьев Рихтера, но включают применение на любых клетках, тканях или органах, специфически поражаемых scFv или Fab фрагментами Ig, у любых видов животных, у которых разрушение таких клеток, или тканей, или органов приводит к сдерживанию или уничтожению видов животных. Эти моноклональные антитела и фаги, проявляющие scFv фрагменты, присоединены к токсинам, таким как гелонин, белок, инактивирующий рибосому, которые не имеют механизма проникновения в клетки и являются нетоксичными, если они не доставлены специфически в клетку, или к другим токсинам, для доставки токсинов в пищеварительный тракт матки завезенных муравьев Рихтера.

В еще одном варианте данное изобретение представляет способ уничтожения муравьев Рихтера, включающий стадию взаимодействия указанных муравьев с полипептидом, полученным по способу, описанному в данном изобретении. Специалист в данной области легко определит оптимальную концентрацию новых полипептидов, описанных в данном изобретении, с помощью обычных экспериментов в зависимости от типа и количества муравьев Рихтера, которые должны быть уничтожены.

Следующие примеры даны с целью иллюстрации различных вариантов данного изобретения и не ограничивают область данного изобретения.

ПРИМЕР 1
Иммунизация мышей клетками микроворинок средней кишки
Мышей Ва1b/с иммунизируют клетками средней кишки, полученными из отложенных яиц маток завезенных муравьев Рихтера. Для иммунизации используют измельченные клетки средней кишки с антигенным комплексом, затем методику двойного отбора (см. пример 4) и иммуногистохимический анализ (см. пример 5) используют для отбора либо scFv фрагментов тяжелой и/или легкой цепи Ig, либо моноклональных Fab фрагментов со специфичностью к клеткам микроворсинок матки завезенных муравьев Рихтера.

Клетки селезенки иммунизированных мышей используют для создания специфичных к определенным видам моноклональных антител, используя стандартную методику культивирования клеток. Моноклональные антитела имеют специфичность к антигенам микроворсинок средней кишки завезенных муравьев Рихтера. Полученные надсадочные жидкости гибридомы отбирают по их специфичности, используя иммуногистохимические методики, описанные в примере 5.

Кроме того, получают фаги антител со специфичностью к определенным видам, демонстрирующие scFv фрагменты тяжелой и/или легкой цепи Ig, которые взаимодействуют с внеклеточным доменом клеток микроворсинок средней кишки. Схематическая пошаговая процедура создания фага, проявляющего scFv фрагменты тяжелой и/или легкой цепи Ig, представлена на чертеже.

ПРИМЕР 2
Получение, амплификация и очистка кДНК из полной РНК, полученной из селезенок иммунизированных мышей
Полную РНК экстрагируют и очищают из селезенок трех иммунизированных мышей. РНК подвергают обратной транскрипции (ОТ) в кДНК, применяя набор (Boehringer Mannheim) и используя два набора затравок: один – специфичный для IgG тяжелых цепей и другой – специфичный для каппа легких цепей [4]. кДНК амплифицируют с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР), используя затравки, специфичные для IgG тяжелой и каппа легкой цепей соответственно, и условия тепловой циклизации, опубликованные ранее [4, 5, 6]. ПЦР-амплифицированные продукты разделяют по размеру с помощью гель-электрофореза.

ПРИМЕР 3
Создание комбинаторной библиотеки scFv фрагментов тяжелой и/или легкой цепи Ig, проявленной на поверхности нитевидного фага
Комбинаторные библиотеки scFv фрагментов тяжелой и/или легкой цепи Ig получают в векторе экспрессии нитевидного фага, используя методику двухстадийного последовательного лигирования, описанную в (4), и набор ImmunoZAP от Stratagene. Вкратце, очищенные гелем продукты ПЦР ферментно расщепляют и продукты ПЦР лигируют в вектор тяжелой цепи – 1Нс2, и в вектор легкой цепи – 1Lc. Сконструированные библиотеки тяжелой и легкой цепи состоят из scFv фрагментов. Далее, конструкции тяжелой и легкой цепи объединяют с получением комбинаторных конструкций Fab. Затем клетки E.coli переносят с библиотекой фага и заражают фагом-хемпером (VCSM13, Stratagene) с получением достаточного количества фагов, проявляющих фрагменты антител, которое является достаточным для скрининга и отбора [4]. scFv фрагменты тяжелой или легкой, а также тяжелой и легкой цепи Ig со специфичностью к V-области тяжелой и легкой цепи иммуноглобулина используют как в виде V-фрагментов единичной цепи (scFv) с высокой степенью родства с целевыми клетками, так и в виде объединенных V-фрагментов тяжелой/легкой цепи (Fab) с высокой степенью родства с целевыми клетками.

ПРИМЕР 4
Двухстадийный отбор для идентификации scFv и Fab фрагментов антител со специфичностью к антигенам мембраны средней кишки матки завезенных муравьев Рихтера
Первая стадия отбора включает взаимодействие полной библиотеки фагов, экспрессирующих scFv и Fab фрагменты антител, со средней кишкой, раскрытой таким образом, чтобы были доступны клетки микроворсинок или диссоциированные клетки, полученные от матки завезенных муравьев Рихтера. Фаг, проявляющий Ig, не способный к связыванию, вымывают, а фаг, проявляющий scFv или Fab фрагменты Ig, который связывается с антигенами средней кишки завезенных муравьев Рихтера с высокой степенью родства, элюируют и сохраняют. Вторую стадию отбора проводят используя препараты средней кишки маток естественных муравьев Рихтера. Собирают только те фаги, проявляющие scFv и Fab фрагменты, которые не способны к связыванию с антигенами мембраны средней кишки маток местных муравьев Рихтера. Эту методику отбора повторяют три раза для получения специфических фрагментов Ig с высокой авидностью и степенью родства для проведения клонирования. Отобранные фаги (те, которые взаимодействуют с антигенами мембраны средней кишки матки завезенных муравьев Рихтера, но не затрагивают маток естественных муравьев Рихтера) генетически конструируют таким образом, что они не могут больше быть проявлены, но могут быть выделены при получении в E.coli. Методика отбора не ограничена данной последовательностью в том, что фаги, проявляющие Ig, могут быть сначала подвергнуты взаимодействию с антигенами микроворсинок матки естественных муравьев Рихтера, и фаги, проявляющие Ig, не провзаимодействовавшие с антигенами микроворсинок матки естественных муравьев Рихтера, могут быть отобраны для взаимодействия с антигенами микроворсинок матки завезенных муравьев Рихтера.

ПРИМЕР 5
Подтверждение того, что отобранные фаги, проявляющие scFv и Fab фрагменты антител, и моноклональные антитела взаимодействуют с клетками микроворсинок средней кишки завезенных муравьев Рихтера
Отобранные фаги, проявляющие scFv и Fab фрагменты (из примера 4 выше) подвергают взаимодействию с различными антигенами клеточных мембран средней кишки, включая антигены клеток микроворсинок. Иммуногистохимическое окрашивание рассеченных тканей средней кишки используют для идентификации клонированных фагов, проявляющих scFv фрагменты тяжелой и легкой цепей или комбинации фрагментов тяжелой и легкой цепи Ig, которые взаимодействуют только с клетками микроворсинок средней кишки матки завезенных муравьев Рихтера. Рассеченную ткань средней кишки подвергают взаимодействию с клонированными фракциями scFv или Fab и исследуют на предмет обнаружения присутствия фага, используя чувствительную иммунопероксидазу VECTASTAIN Elite ABC system (Vector Laboratories). Клоны, которые дают положительную реакцию с клетками микроворсинок матки завезенных муравьев Рихтера и не взаимодействуют с клетками микроворсинок матки естественных муравьев Рихтера? амплифицируют в E. coli и используют как описано в примерах 6 и 7. Для отбора моноклональных антител рассеченную ткань средней кишки подвергают взаимодействию с надсадочными жидкостями гибридомы, промывают и подвергают взаимодействию с вторичным антителом кролика, конъюгированным с помощью щелочной фосфатазы к Ig мыши. Затем добавляют субстрат, и микроскопические препараты исследуют на предмет положительных реакций к антигенам микроворсинок средней кишки матки завезенных муравьев Рихтера и на отсутствие реакций с антигенами микроворсинок средней кишки естественных муравьев Рихтера.

ПРИМЕР 6
Подтверждение того, что отобранные фаги, проявляющие фрагменты антител, а также моноклональные антитела являются эффективными in vivo
Моноклональные антитела и scFv фрагменты тяжелой и/или легкой цепи Ig, амплифицированные в E.coli, которые отобраны по специфичности и высокой степени родственного связывания с микроворсинками завезенных муравьев Рихтера, тестируют для подтверждения способности быть интернализированными клетками микроворсинок при пероральном введении. Колонии муравьев (завезенных и естественных) помещают в контролируемую среду, причем каждая колония состоит из единственной матки завезенных муравьев Рихтера, откладывающей яйца, 50 неоплодотворенных крылатых маток муравьев Рихтера и приблизительно 5000 рабочих муравьев. Колонии подкармливают либо моноклональными антителами, либо scFv и Fab фрагментами, примешанными в соевую муку. Матку, откладывающую яйца, и неоплодотворенных маток в каждой колонии умерщвляют и удаляют среднюю кишку. Образцы тканей, полученных из средней кишки, замораживают и эти образцы исследуют на присутствие и интернализацию scFv фрагментов тяжелой и/или легкой цепи Ig по методике иммуногистохимического окрашивания, описанной выше. Анализ моноклональных Fab фрагментов проводят используя эту методику.

ПРИМЕР 7
Подтверждение того, что фаги, проявляющие генерированные scFv фрагменты Ig, и моноклональные Fab фрагменты являются эффективной системой доставки для целевого поражения завезенных муравьев Рихтера
Белок, инактивируеммй рибосомой, гелонин, бактериальные эндотоксины и другие токсины присоединяют к моноклональным Fab фрагментам и scFv фрагментам тяжелой и/или легкой цепи Ig, используя следующие методики, широко применяемые методы химического конъюгирования или присоединения, которые успешно применялись для конъюгирования токсинов с моноклональными Fab фрагментами антител или scFv фрагментами тяжелой цепи Ig; с помощью биспецифических (Fab)2, или scFv гетеродимеров тяжелой цепи со специфичностью к целевым антигенам и специфичностью к токсинам, генерированным in vitro с помощью установления стабильной тиоэфирной связи, используя разработанные методики (10-12); in vivo, используя технологию ДНК и методики генной инженерии для получения пептидов димеризации с получением двухвалентных димеров (со специфичностью к целевому антигену и токсину) в E.coli или клетках млекопитающих, используя описанные методики [13] и с помощью генетического конструирования ферментно-активного домена scFv тяжелой цепи токсина, экспрессированного и выделенного с помощью бактерий, используя описанную методику [14].

Было проведено “тест-питание” scFv фрагментов тяжелой и/или легкой цепи, или моноклокальных Fab фрагментов для определения их способности связываться с антигенами микроворсинок средней кишки матки завезенных муравьев Рихтера, но при этом не затрагивать антигены микроворсинок средней кишки матки естественных муравьев Рихтера в контролируемых определенных лабораторных колониях завезенных и естественных муравьев Рихтера, используя иммуногистологические методики для установления присоединения и интернализации фрагментов Ig антигенами микроворсинок средней кишки. Тестирование целевых систем scFv фрагментов тяжелой и/или легкой цепи и моноклональных Fab фрагментов + токсинов в лабораторных колониях муравьев и в полевых условиях было приведено с целью определения способности селективного поражения завезенных муравьев Рихтера.

В данном описании использовали ссылки на следующие источники:
1. Holldobler, B. and E.O. Wilson 1990. The Ants. The Belknap Press, Cambridge, Mass.

2. Barbas, C. and R. Lerner. 1991. Combinatorial immunoglobulin libraries on the surface of phage (phabs): rapid selection of antigen-specific. Fab. Methods: Comp. Met. Enzym. 2:119.

3. Ames, R., M. Tornetta, C. Jones and P. Tsui. 1994. Isolation of neutralizing anti-C5a antibodies from a filamentous phage monovalent Fab display library. J. Immun. 152:4572.

4. Ames, et al. (15 co-authors). 1995. Neutralizing murine monoclonal antibodies to human IL-5 isolated from hybridomas and a filamentous phage Fab display library. J. Immunol. 154:6355.

5. Winter, G., A.D. Griffiths, R.F. Hawkins and H.R. Hoogenboom. 1994. Making antibodies by phage display technology. Ann. Rev. Immunol. 12:433.

6. Vaughan, T.J., et al., 1996. Human antibodies with subnanomolar affinities isolated a large non-immunized phage display library. Nature Вiotech. 14:309.

7. Kruif, J. de, et al., 1996. New perspectives on recombinant human antibodies. Immunology Today 17:453.

8. Kruif, J. de, and T. Logtenberg. 1996. Leucine zipper dimerized bivalent and bispecific scFv antibodies from a semi-synthetic antibody phage display library. J. Bio. Chem. 271:7630.

9. Davies, J. and L. Riechmann. 1995. Antibody VH domains as small recognition units. Biotechnology 13:475.

10. French, R.С. Penney, A. Browning, F. Stirpe, A. George and M. Glennie. 1995. Delivery of the ribosome-inactivating protein, gelonin, to lymphoma cells via CD22 and CD35 using bispecific antibodies. Brit. J. Cancer 71:986.

11. Better, M., S. Bernhard, D. Fishwild, P. Nolan, R. Bauer, A. Kung, and S. Carroll. 1994. Gelonin analogs with engineered cysteine residues form antibody immunoconjugates with unique properties. J.Biol. Chem. 269:9644.

12. Glennie, M.J., H.M. McBride, A.T. Worth, and G.T. Stevenson. Preparation and performance of bispecific F(ab’_)₂ antibody containing thioether-linked Fab’_ fragments. J.Immunol. 139:2367-2375, 1987.

13. Holliger, P., and G. Winter. Engineering bispecific antibodies. Current Opinion in Biotechnology 4: 446-449, 1993.

14. Maurer-Gebhard, M., M. Schmidt, M. Azemar, U. Altenschmidt, E. Stocklin, W. Wels and B. Groner. Systemic treatment with a recombinant erbB-2 receptor-specific tumor toxin efficiently reduces pulmonary metastases in mice injected with genetically modified carcinoma cells. Cancer Res. 58: 2661-2666, 1998.

Любые патенты или публикации, упомянутые в данном описании, определяют уровень специалистов в данной области, которых данное изобретение касается. Более того, эти патенты и публикации включены в данное описание в качестве ссылок в том же объеме, как если бы каждая конкретная публикация была специально и отдельно отмечена как ссылка. Специалист в данной области легко поймет, что данное изобретение хорошо адаптировано для определения объектов и выделения конечных целей и преимуществ, а также тех объектов, целей и преимуществ, которые присущи данному изобретению. Данные примеры, вместе со способами, методиками, способами применения, молекулами и определенными соединениями, описанными в данном изобретении, в данном случае представляющие предпочтительные варианты, являются примерными и не ограничивают область данного изобретения. Специалист в данной области может вносить в них изменения и предлагать новые способы применения, если они входят в область данного изобретения, которая определена формулой изобретения.

Формула изобретения

1. Способ получения полипептида, который может связываться с антигеном-мишенью, экспрессируемом на клетке-мишени, причем указанный полипептид содержит активный домен токсина, включающий следующие стадии: создание проявляющей библиотеки фагов, экспрессирующих scFv фрагменты тяжелой и/или легкой цепи Ig; взаимодействие указанной проявляющей библиотеки фагов, экспрессирующих scFv фрагменты тяжелой и/или легкой цепи Ig, с указанными клетками-мишенями, представляющими собой клетку микроворсинки средней кишки завезенного муравья Рихтера; промывание указанных прореагировавших клеток-мишеней для удаления несвязанного фага, экспрессирующего scFv фрагменты Ig; элюирование связанного фага, экспрессирующего scFv фрагменты Ig, из указанных клеток-мишеней; взаимодействие указанного элюированного фага, экспрессирующего scFv фрагменты Ig, с клетками, не являющимися мишенями; промывание указанных прореагировавших клеток, не являющихся мишенями, для удаления несвязанного фага, экспрессирующего scFv фрагменты Ig; конструирование указанного несвязанного фага для не фагового проявления; амплификации scFv фрагментов тяжелой и/или легкой цепи Ig в E.coli; сбор секретированных scFv фрагментов Ig; присоединение указанных секретированных scFv фрагментов Ig к токсину для получения полипептида, который специфически связывается с указанным антигеном-мишенью, причем указанный полипептид содержит ферментативно-активный домен указанного токсина.

2. Способ по п.1, отличающийся тем, что указанные секретированные scFv фрагменты присоединяют к указанному токсину способом, выбранным из группы, состоящей из химического перекрестного связывания, перекрестного связывания с помощью биспецифического scFv, обладающего специфичностью связывания с указанным антигеном-мишенью и указанным токсином, и генно-инженерных методик.

3. Способ по п.1, отличающийся тем, что указанным антигеном-мишенью является поверхностно-клеточная молекула клетки-мишени.

4. Способ по п.1, отличающийся тем, что указанное создание проявляющей библиотеки фагов, экспрессирующих scFv фрагменты тяжелой и/или легкой цепи Ig, проводят лигированием кДНК в векторы тяжелой цепи и векторы легкой цепи.

5. Полипептид, полученный способом по п.1.

6. Способ уничтожения муравья Рихтера, включающий стадию контактирования указанного муравья с полипептидом по п.5.

РИСУНКИ

MM4A – Досрочное прекращение действия патента СССР или патента Российской Федерации на изобретение из-за неуплаты в установленный срок пошлины за поддержание патента в силе

Дата прекращения действия патента: 10.07.2006

Извещение опубликовано: 20.12.2007 БИ: 35/2007