Патент на изобретение №2208640

(54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ L-АРГИНИНА, ШТАММ Escherichia coli – ПРОДУЦЕНТ L-АРГИНИНА

(57) Реферат:

Изобретение относится к биотехнологии. L-аргинин получают культивированием бактерии Escherichia coli, обладающей способностью к утилизации ацетата. После накопления L-аргинин выделяют из культуральной жидкости. В качестве продуцента L-аргинина используют штамм Escherichia coli 382 (ВКПМ В-7926), обладающий способностью к утилизации ацетата. Данное изобретение позволяет получить более высокий выход L-аргинина при использовании бактерии Escherichia coli, способной утилизировать ацетат. 2 с. и 2 з.п.ф-лы, 3 табл.

Область применения изобретения
Настоящее изобретение относится к Escherichia coli – продуценту L-аргинина и способу получения L-аргинина методом ферментации с использованием Escherichia coli. L-аргинин является промышленно полезной аминокислотой, используемой в качестве компоненты реагентов – стимуляторов функции печени, компоненты для трансфузии аминокислот, препаратов смесей полного набора аминокислот и подобных целей.

Описание существовавших ранее методов
Известно, что некоторые мутанты Escherichia coli, устойчивые к аналогам аргинина и пиримидинам, продуцируют аргинин (Pierard A. and Glansdorf N., Mol. Gen. Genet., 118, 235, 1972; and Glansdorf N., Biosynthesis of arginine and polyamines. In “Escherichia coli and Salm. Thyphimurium, 1996). Также известны способы получения аргинина с использованием мутантных Е. coli, устойчивых к некоторому количеству других ингибиторов, или рекомбинантных штаммов Е. coli, в которые введен ген, кодирующий фермент биосинтеза аргинина.

В ходе биосинтеза аргинина в Е. coli К 12 потребляется один моль ацетил-коэнзима А и высвобождается один моль уксусной кислоты с образованием одной молекулы аргинина. В результате образования ацетата как побочного продукта реакции значительная часть источника углерода расходуется впустую, кроме того, накопление ацетата ухудшает условия роста культуры продуцентов аргинина.

Также известно, что Е. coli не может эффективно утилизировать ацетат в качестве источника углерода.

Краткое описание изобретения
Исходя из изложенной выше точки зрения, авторы настоящего изобретения предположили, что продукция аргинина станет выше, если штамм – продуцент аргинина будет обладать способностью к повторной утилизации уксусной кислоты. Соответственно целью настоящего изобретения является предоставление штамма Е. coli – продуцента аргинина, утилизирующего уксусную кислоту, и способа получения аргинина с использованием штамма.

Затем авторы настоящего изобретения сконструировали мутантные штаммы Е. coli – продуценты аргинина, способные к утилизации уксусной кислоты, и добились успеха в повышении продуктивности аргинина штаммом Е. coli – продуцентом аргинина. Таким образом было совершено настоящее изобретение.

А именно настоящее изобретение предоставляет Escherichia coli, обладающую способностью к продукции аргинина и способностью к утилизации ацетата.

Более того, настоящее изобретение предоставляет способ получения аргинина, включающий стадии выращивания штамма Е. coli, обладающего способностью к утилизации ацетата и способностью к продукции аргинина, в питательной среде с целью получения и накопления аргинина в питательной среде, и извлечения аргинина из культуральной жидкости.

В настоящем изобретении аминокислоты обладают L-конфигурацией.

Далее настоящее изобретение будет разъяснено более детально.

Е. coli согласно настоящему изобретению обладает способностью к утилизации ацетата и способностью к продукции аргинина. Е. coli, обладающая способностью к утилизации ацетата и способностью к продукции аргинина, может быть получена путем придания штамму Е. coli, обладающему способностью к продукции аргинина, способности к утилизации ацетата или путем придания штамму Е. coli, обладающему способностью к утилизации ацетата, способности к продукции аргинина.

В рамках настоящего изобретения термин “способность к продукции аргинина” означает способность штамма Е. coli, используемого в настоящем изобретении, к продукции и накоплению аргинина в питательной среде, когда штамм Е. coli выращивается в питательной среде. Термин “способность к утилизации ацетата” означает способность утилизировать уксусную кислоту или ацетат более эффективно, чем родительский штамм, например способность штамма Е. coli, используемого в настоящем изобретении, расти быстрее, чем родительский штамм, когда штамм Е. coli выращивается в питательной среде, содержащей уксусную кислоту или ацетат в качестве единственного источника углерода. Более точно можно сказать, что штамм Е. coli обладает способностью к утилизации ацетата, если штамм растет быстрее, чем родительский штамм, когда штамм выращивается в подходящих условиях в питательной среде, содержащей уксусную кислоту или ацетат в качестве единственного источника углерода, например в жидкой минимальной среде А, описанной ниже, содержащей 5 г/л ацетата аммония. Более точно можно сказать, что штамм Е. coli обладает способностью к утилизации ацетата, если штамм в подходящих условиях в течение 2 дней при 37^oС образует колонии при культивации на агаризованной среде, содержащей уксусную кислоту или ацетат в качестве единственного источника углерода, например в минимальной среде А, описанной ниже, содержащей 5 г/л ацетата аммония и агар. Термин “подходящие условия” относится к температуре, рН, подаче воздуха или необязательному присутствию необходимых питательных добавок или подобным составляющим для штамма Е. coli, который используется для выращивания.

В качестве примера метода получения Е. coli согласно настоящему изобретению ниже будет приведен метод получения мутантов, обладающих способностью к утилизации ацетата, из штамма Е. coli, обладающего способностью к продукции аргинина.

Выбор бактерии Е. coli, обладающей способностью к продукции аргинина, не ограничен каким-либо образом при условии, что ей может быть придана способность к утилизации ацетата. К таким штаммам Е. coli относятся штаммы – продуценты аргинина, выведенные из Е. coli K-12, В, С или их производных.

В качестве примеров Е. coli – продуцентов аргинина могут быть приведены следующие: мутанты, обладающие устойчивостью к -метилметионину, р-фторфенилаланину, D-аргинину, аргинин гидроксамату, S-(2-аминоэтил)-цистеину, -метилсерину, -2-тиенилаланину или сульфагуанидину (выложенная заявка Японии 56-106598), штаммы – продуценты аргинина, в которые введен ген argA, кодирующий N-ацетилглутамат синтазу (выложенная заявка Японии 57-5693) или подобные им. Штамм Е. coli 237, описанный в приведенных ниже примерах, также является предпочтительным штаммом – продуцентом аргинина. Штамм 237 был депонирован во Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов (ВКПМ) под инвентарным номером ВКПМ В-7925 10 апреля 2000.

Мутантный штамм, обладающий способностью к утилизации ацетата, может быть получен из штамма – продуцента аргинина, как описано выше, например, путем мутагенеза штамма – продуцента аргинина и отбора штаммов, которые могут расти на минимальной питательной среде, содержащей в качестве единственного источника углерода уксусную кислоту или ацетат. Мутагенез может быть осуществлен, например, при УФ-облучении или с помощью реагента, обычно используемого для искусственного мутагенеза, такого как 1-метил-3-нитро-1-нитрозогуанидина (NTG) и азотистой кислоты. Мутагенез и отбор мутантных штаммов, обладающих способностью к утилизации ацетата, может быть осуществлена два или большее количество раз.

С высокой эффективностью аргинин может быть получен при выращивании штаммов Е. coli, описанных выше, которые обладают способностью к утилизации ацетата и к продукции аргинина, в питательной среде с целью продукции и накопления аргинина в питательной среде, и извлечения аргинина из культуральной жидкости.

Ацетилирование глутамата с образованием N-ацетилглутамата и деацетилирование N-ацетилорнитина с образованием орнитина в биосинтезе аргинина в кориноформных бактериях катализируется одним ферментом – орнитин ацетилтрансферазой. С другой стороны, ацетилирование и деацетилирование в биосинтезе аргинина в Е. coli катализируются различными ферментами – N-ацетилглутамат синтазой и N-ацетилорнитиназой соответственно. Поэтому влияние утилизации уксусной кислоты как побочного продукта на продукцию аргинина известно не было.

В способе получения аргинина согласно настоящему изобретению выращивание Е. coli, накопление и извлечение аргинина из жидкой питательной среды может быть осуществлено обычным способом, традиционно используемым в методах ферментации, в которых аргинин продуцируется с использованием Е. coli.

В качестве источника углерода могут быть использованы сахара, такие как глюкоза, лактоза, галактоза, фруктоза или гидролизат крахмала; спирты, такие как глицерин или сорбитол; или органические кислоты, такие как уксусная кислота, фумаровая кислота, лимонная кислота или янтарная кислота.

В качестве источника азота могут быть использованы неорганические соли аммония, такие как сульфат аммония, хлорид аммония или фосфат аммония; органический азот в виде гидролизата соевых бобов; газообразный аммиак или водный раствор аммиака.

Желательно предоставить требуемые вещества, такие как витамин B₁ и L-изолейцин или дрожжевой экстракт, для поддержания необходимого количества органических питательных веществ. Кроме указанного выше, в небольших количествах добавляются, если необходимо, фосфат калия, сульфат магния, ионы железа, марганца или подобные вещества.

Выращивание проводят предпочтительно в аэробных условиях в течение 16-72 часов. Температура при выращивании поддерживается в пределах от 25^oС до 45^oС, рН поддерживается в пределах 5-8. Неорганические или органические, кислотные или щелочные соединения так же, как и газообразный аммиак или подобные, могут быть использованы для установления необходимого значения рН.

Извлечение аргинина из культуральной жидкости обычно осуществляется комбинацией методов ионного обмена на смолах и других известных методов.

Наилучший способ осуществления изобретения
Далее настоящее изобретение будет разъяснено более подробно со ссылкой на следующие примеры.

Пример 1: Получение мутантов, утилизирующих ацетат
Мутанты, которые хорошо росли на агаризованной среде М9, содержащей в качестве единственного источника углерода и азота ацетат аммония (5 мг/мл), были получены из мутантного штамма Е. coli 237 – продуцента аргинина. Штамм 237 является устойчивым к аналогу пиримидина, 6-азаурацилу, мутантом, полученным из Е. coli K12 ilvA::Tn5 с использованием NTG. Штамм 237 растет плохо на агаризованной среде М9, содержащей в качестве единственного источника углерода и азота ацетат аммония. Штамм 237 был депонирован во Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов (ВКПМ) под инвентарным номером ВКПМ В-7925.

Клетки штамма 237 были выращены в течение ночи в L-бульоне со встряхиванием (в пробирках, 37^oС) и собраны центрифугированием. Затем клетки были ресуспендированы в солевом растворе (0.8%), содержащем 0.1 мг/мл NTG. После воздействия NTG в течение 30 минут при 37^oС клетки были осаждены, дважды промыты солевым раствором и высеяны на агаризованную минимальную среду А, содержащую 5 г ацетата аммония, 6 г Na₂HPO₄, 3 г КН₂РO₄, 0.5 г NaCl, 0.1 г тиамина, 0.1 г L-изолейцина, 15 г агара на 1 л воды (рН 7.0).

Чашки инкубировались в течение 5 дней при 37^oС. Колонии, появившиеся на чашках в течение 2 дней, были отобраны и очищены нанесением полосок на такие же чашки с агаром. Родительский штамм 237 образовал колонии только после 5 дней выращивания. Частота образования мутантов, утилизирующих ацетат, составляла величину 610^-5. Была проверена продукция аргинина семьюдесятью очищенными штаммами. Около ¹/₄ выделенных мутантов были более продуктивны, чем родительский штамм 237. Среди них наиболее продуктивньм был штамм 382. Штамм 382 был депонирован во Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов (ВКПМ) под инвентарным номером ВКПМ В-7926 10 апреля 2000.

Пример 2: Способность к росту новых мутантов на среде с ацетатом
Порции из 2 мл жидкой минимальной среды А (агар добавлен не был), содержащей в качестве единственного источника углерода либо ацетат аммония (5 г/л), либо глюкозу (5 г/л), были помещены в пробирки, инокулированы одной петлей нового штамма 382, другим мутантом – продуцентом аргинина 383 и их родительским штаммом 237, и инкубировались в течение 16 часов при 32^oС со встряхиванием. Прирост определялся путем измерения оптической плотности культуры при 540 нм. Оптическая плотность среды в начале выращивания составляла около 0.05. Результаты показаны в таблице 1.

Пример 3: Продукция аргинина новыми мутантами – продуцентами аргинина при ферментации в пробирках
Новые штаммы 382, 383 и их родительский штамм 237 были выращены в питательной среде для ферментации. Среда для ферментации содержала 60 г глюкозы, 25 г сульфата аммония, 2 г KH₂PO₄, 1 г MgSO₄7H₂O, 0.1 мг тиамина, 5 г дрожжевого экстракта (Difco), 25 г карбоната кальция на 1 л воды (рН 7.2). Глюкоза и мел были стерилизованы по отдельности. Порции из 2 мл питательной среды были помещены в пробирки, инокулированы одной петлей тестируемых микроорганизмов, и их выращивание проводилось при 32^oС в течение 3 дней со встряхиванием. Накопленное в культуральной жидкости количество аргинина показано в таблице 2.

Пример 4: Продукция аргинина новыми мутантами – продуцентами аргинина в емкости ферментера
Новый штамм 382 и его родительский штамм 237 выращивались со встряхиванием при 32^oС в течение 8 часов в L-бульоне. Затем 60 мл полученной посевной культуры были перенесены в 1 л емкость ферментера, содержащую 0.5 л среды для ферментации, после чего последовал процесс выращивания в перемешиванием (700 об/мин) при 32^oС и скорости аэрации 0.5 л/мин. Среда для ферментации содержала 100 г глюкозы, 9 г сульфата аммония, 1 г КН₂РO₄, 0.4 г MgSO₄7H₂O, 0.02 г FeSO₄7H₂O, 0.02 г MnSО₄7H₂О, 2 г общего количества азота в гидролизате соевых бобов, 0.3 г L-изолейцина, 0.4 г тиамина в 1 л воды (рН 7.0). Для поддержания рН 7.0 и снабжения источником азота в ходе выращивания добавлялся раствор аммиака (4.7 М). Выращивание проводилось в течение 42 часов. Накопленное в культуральной жидкости количество аргинина и выход по глюкозе приведены в таблице 3.

Мутант, утилизирующий ацетат, обладал более высокой продуктивностью аргинина, чем родительский штамм.

Формула изобретения

1. Способ получения L-аргинина, включающий стадии выращивания Escherichia coli – продуцента L-аргинина в питательной среде и выделения L-аргинина из культуральной жидкости, отличающийся тем, что в качестве продуцента L-аргинина используют клетки Escherichia coli, обладающие способностью к утилизации ацетата.

2. Способ по п.1, отличающийся тем, что такая бактерия образует колонии в течение 2 дней при 37^oС при выращивании на агаризованной среде, содержащей в качестве единственного источника углерода уксусную кислоту или ацетат.

3. Способ по п.1, отличающийся тем, что такая бактерия является производной от Escherichia coli K 12.

4. Штамм Escherichia coli 382 (ВКПМ В-7926), обладающий способностью к утилизации ацетата – продуцент L-аргинина.

РИСУНКИ