Патент на изобретение №2208640
|
||||||||||||||||||||||||||
(54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ L-АРГИНИНА, ШТАММ Escherichia coli – ПРОДУЦЕНТ L-АРГИНИНА
(57) Реферат: Изобретение относится к биотехнологии. L-аргинин получают культивированием бактерии Escherichia coli, обладающей способностью к утилизации ацетата. После накопления L-аргинин выделяют из культуральной жидкости. В качестве продуцента L-аргинина используют штамм Escherichia coli 382 (ВКПМ В-7926), обладающий способностью к утилизации ацетата. Данное изобретение позволяет получить более высокий выход L-аргинина при использовании бактерии Escherichia coli, способной утилизировать ацетат. 2 с. и 2 з.п.ф-лы, 3 табл. Область применения изобретения Настоящее изобретение относится к Escherichia coli – продуценту L-аргинина и способу получения L-аргинина методом ферментации с использованием Escherichia coli. L-аргинин является промышленно полезной аминокислотой, используемой в качестве компоненты реагентов – стимуляторов функции печени, компоненты для трансфузии аминокислот, препаратов смесей полного набора аминокислот и подобных целей. Описание существовавших ранее методов Известно, что некоторые мутанты Escherichia coli, устойчивые к аналогам аргинина и пиримидинам, продуцируют аргинин (Pierard A. and Glansdorf N., Mol. Gen. Genet., 118, 235, 1972; and Glansdorf N., Biosynthesis of arginine and polyamines. In “Escherichia coli and Salm. Thyphimurium, 1996). Также известны способы получения аргинина с использованием мутантных Е. coli, устойчивых к некоторому количеству других ингибиторов, или рекомбинантных штаммов Е. coli, в которые введен ген, кодирующий фермент биосинтеза аргинина. В ходе биосинтеза аргинина в Е. coli К 12 потребляется один моль ацетил-коэнзима А и высвобождается один моль уксусной кислоты с образованием одной молекулы аргинина. В результате образования ацетата как побочного продукта реакции значительная часть источника углерода расходуется впустую, кроме того, накопление ацетата ухудшает условия роста культуры продуцентов аргинина. Также известно, что Е. coli не может эффективно утилизировать ацетат в качестве источника углерода. Краткое описание изобретения Исходя из изложенной выше точки зрения, авторы настоящего изобретения предположили, что продукция аргинина станет выше, если штамм – продуцент аргинина будет обладать способностью к повторной утилизации уксусной кислоты. Соответственно целью настоящего изобретения является предоставление штамма Е. coli – продуцента аргинина, утилизирующего уксусную кислоту, и способа получения аргинина с использованием штамма. Затем авторы настоящего изобретения сконструировали мутантные штаммы Е. coli – продуценты аргинина, способные к утилизации уксусной кислоты, и добились успеха в повышении продуктивности аргинина штаммом Е. coli – продуцентом аргинина. Таким образом было совершено настоящее изобретение. А именно настоящее изобретение предоставляет Escherichia coli, обладающую способностью к продукции аргинина и способностью к утилизации ацетата. Более того, настоящее изобретение предоставляет способ получения аргинина, включающий стадии выращивания штамма Е. coli, обладающего способностью к утилизации ацетата и способностью к продукции аргинина, в питательной среде с целью получения и накопления аргинина в питательной среде, и извлечения аргинина из культуральной жидкости. В настоящем изобретении аминокислоты обладают L-конфигурацией. Далее настоящее изобретение будет разъяснено более детально. Е. coli согласно настоящему изобретению обладает способностью к утилизации ацетата и способностью к продукции аргинина. Е. coli, обладающая способностью к утилизации ацетата и способностью к продукции аргинина, может быть получена путем придания штамму Е. coli, обладающему способностью к продукции аргинина, способности к утилизации ацетата или путем придания штамму Е. coli, обладающему способностью к утилизации ацетата, способности к продукции аргинина. В рамках настоящего изобретения термин “способность к продукции аргинина” означает способность штамма Е. coli, используемого в настоящем изобретении, к продукции и накоплению аргинина в питательной среде, когда штамм Е. coli выращивается в питательной среде. Термин “способность к утилизации ацетата” означает способность утилизировать уксусную кислоту или ацетат более эффективно, чем родительский штамм, например способность штамма Е. coli, используемого в настоящем изобретении, расти быстрее, чем родительский штамм, когда штамм Е. coli выращивается в питательной среде, содержащей уксусную кислоту или ацетат в качестве единственного источника углерода. Более точно можно сказать, что штамм Е. coli обладает способностью к утилизации ацетата, если штамм растет быстрее, чем родительский штамм, когда штамм выращивается в подходящих условиях в питательной среде, содержащей уксусную кислоту или ацетат в качестве единственного источника углерода, например в жидкой минимальной среде А, описанной ниже, содержащей 5 г/л ацетата аммония. Более точно можно сказать, что штамм Е. coli обладает способностью к утилизации ацетата, если штамм в подходящих условиях в течение 2 дней при 37oС образует колонии при культивации на агаризованной среде, содержащей уксусную кислоту или ацетат в качестве единственного источника углерода, например в минимальной среде А, описанной ниже, содержащей 5 г/л ацетата аммония и агар. Термин “подходящие условия” относится к температуре, рН, подаче воздуха или необязательному присутствию необходимых питательных добавок или подобным составляющим для штамма Е. coli, который используется для выращивания. В качестве примера метода получения Е. coli согласно настоящему изобретению ниже будет приведен метод получения мутантов, обладающих способностью к утилизации ацетата, из штамма Е. coli, обладающего способностью к продукции аргинина. Выбор бактерии Е. coli, обладающей способностью к продукции аргинина, не ограничен каким-либо образом при условии, что ей может быть придана способность к утилизации ацетата. К таким штаммам Е. coli относятся штаммы – продуценты аргинина, выведенные из Е. coli K-12, В, С или их производных. В качестве примеров Е. coli – продуцентов аргинина могут быть приведены следующие: мутанты, обладающие устойчивостью к ![]() ![]() ![]() Далее настоящее изобретение будет разъяснено более подробно со ссылкой на следующие примеры. Пример 1: Получение мутантов, утилизирующих ацетат Мутанты, которые хорошо росли на агаризованной среде М9, содержащей в качестве единственного источника углерода и азота ацетат аммония (5 мг/мл), были получены из мутантного штамма Е. coli 237 – продуцента аргинина. Штамм 237 является устойчивым к аналогу пиримидина, 6-азаурацилу, мутантом, полученным из Е. coli K12 ilvA::Tn5 с использованием NTG. Штамм 237 растет плохо на агаризованной среде М9, содержащей в качестве единственного источника углерода и азота ацетат аммония. Штамм 237 был депонирован во Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов (ВКПМ) под инвентарным номером ВКПМ В-7925. Клетки штамма 237 были выращены в течение ночи в L-бульоне со встряхиванием (в пробирках, 37oС) и собраны центрифугированием. Затем клетки были ресуспендированы в солевом растворе (0.8%), содержащем 0.1 мг/мл NTG. После воздействия NTG в течение 30 минут при 37oС клетки были осаждены, дважды промыты солевым раствором и высеяны на агаризованную минимальную среду А, содержащую 5 г ацетата аммония, 6 г Na2HPO4, 3 г КН2РO4, 0.5 г NaCl, 0.1 г тиамина, 0.1 г L-изолейцина, 15 г агара на 1 л воды (рН 7.0). Чашки инкубировались в течение 5 дней при 37oС. Колонии, появившиеся на чашках в течение 2 дней, были отобраны и очищены нанесением полосок на такие же чашки с агаром. Родительский штамм 237 образовал колонии только после 5 дней выращивания. Частота образования мутантов, утилизирующих ацетат, составляла величину 6 ![]() Порции из 2 мл жидкой минимальной среды А (агар добавлен не был), содержащей в качестве единственного источника углерода либо ацетат аммония (5 г/л), либо глюкозу (5 г/л), были помещены в пробирки, инокулированы одной петлей нового штамма 382, другим мутантом – продуцентом аргинина 383 и их родительским штаммом 237, и инкубировались в течение 16 часов при 32oС со встряхиванием. Прирост определялся путем измерения оптической плотности культуры при 540 нм. Оптическая плотность среды в начале выращивания составляла около 0.05. Результаты показаны в таблице 1. Пример 3: Продукция аргинина новыми мутантами – продуцентами аргинина при ферментации в пробирках Новые штаммы 382, 383 и их родительский штамм 237 были выращены в питательной среде для ферментации. Среда для ферментации содержала 60 г глюкозы, 25 г сульфата аммония, 2 г KH2PO4, 1 г MgSO4 ![]() Новый штамм 382 и его родительский штамм 237 выращивались со встряхиванием при 32oС в течение 8 часов в L-бульоне. Затем 60 мл полученной посевной культуры были перенесены в 1 л емкость ферментера, содержащую 0.5 л среды для ферментации, после чего последовал процесс выращивания в перемешиванием (700 об/мин) при 32oС и скорости аэрации 0.5 л/мин. Среда для ферментации содержала 100 г глюкозы, 9 г сульфата аммония, 1 г КН2РO4, 0.4 г MgSO4 ![]() ![]() ![]() Формула изобретения 1. Способ получения L-аргинина, включающий стадии выращивания Escherichia coli – продуцента L-аргинина в питательной среде и выделения L-аргинина из культуральной жидкости, отличающийся тем, что в качестве продуцента L-аргинина используют клетки Escherichia coli, обладающие способностью к утилизации ацетата. 2. Способ по п.1, отличающийся тем, что такая бактерия образует колонии в течение 2 дней при 37oС при выращивании на агаризованной среде, содержащей в качестве единственного источника углерода уксусную кислоту или ацетат. 3. Способ по п.1, отличающийся тем, что такая бактерия является производной от Escherichia coli K 12. 4. Штамм Escherichia coli 382 (ВКПМ В-7926), обладающий способностью к утилизации ацетата – продуцент L-аргинина. РИСУНКИ
|
||||||||||||||||||||||||||